《重组DNA技术》课件

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1、第二十章重组DNA技术recombinantDNAtechnique第一节重组DNA技术的基本过程BasicProcessofRecombinantDNATechnology*2一、重组DNA技术相关概念重组DNA技术（RecombinantDNATechnology）：是在体外将不同来源的特异基因或DNA片段插入载体分子，构建成重组DNA分子；并将它导入到合适的受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，筛选出含有目的基因的转化子细胞；再进行扩增、获取大量同一DNA分子。*3亦称DNA克隆(DNAcloning)，或基因克隆(genecloning)。克隆化(cloning)：获取这类

2、同一的DNA分子群体、细胞群体或个体群体的过程，即无性繁殖。重组DNA(recombinantDNA,)：又称嵌合DNA（chimeraDNA），采用克隆技术把来自不同生物的外源DNA插入载体分子所形成的杂合DNA分子。*4克隆(clone)：指从同一始祖经无性繁殖传代而来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体；分－－分离目的基因并进行必要的改造切－－限制酶切目的基因与载体接－－拼接目的基因与载体成重组载体转－－将重组载体转导入受体细胞筛－－筛选出含重组DNA的细胞等二、DNA重组技术基本程序*5思考题1重组DNA技术的基本过程（1）*6重组DNA技术的基本过程（2）*7思考

3、题1*8CommonEnzymesUsedinRecombinantDNATechnology第二节重组DNA技术中常用工具酶一、限制性核酸内切酶（restrictonEndonuclease）是一类能识别双链DNA中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶，又称为限制酶（restrictionenzyme）。主要是从原核生物中分离纯化而来。——基因工程的手术刀----“切”与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。*9第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第四个字母代表株；用罗马数字

4、表示发现的先后次序。（一）限制酶的命名：HindⅢ属种株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶一、限制性核酸内切酶*10Ⅰ和Ⅲ型限制酶通常是相对分子量较大的多亚基蛋白质复合物，同时具有内切酶和甲基化酶活性，反应过程中需有Mg2+和ATP参与。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型（基因工程技术中常用Ⅱ型）。（二）限制酶的分类：Ⅱ型限制酶通常以同源二聚体形式存在，只具有核酸内切酶活性而无甲基化酶活性，反应过程中只需有Mg2+参与而不需有ATP参与。*11Ⅱ类酶识别序具有回文结构(palindrome)特点，即具有双重旋转对称结构的DNA反向重复双链序列。（三）Ⅱ型限制酶

5、的作用特点：1.基本特性：大部分Ⅱ型限制酶都能识别由4~8个核苷酸组成的特定序列。*12思考题2*13图20-3限制酶EcoRⅠ对双链DNA分子的切割作用BamHⅠGGATCCCCTAGGGTCCAGGACCTG+平端切口GCCTAGGATCCG+粘端切口HindⅡGTCGACCAGCTG平或钝末端（bluntend)粘性末端（stickyend)切口：平端切口、粘端切口*14GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ2.同裂酶来源不同但能识别相同序列，切割DNA后产生相同的黏性末端的限制酶，又称同功异

6、源酶。*15BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA3.同尾酶识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的黏性末端的限制酶称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为配伍未端(compatibleend)。*164.可变酶识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个核苷酸。为Ⅱ型限制酶的特例。如：BstpⅠGGTNACCCCANTGG*17如：BblⅠCGGN(N)4CCG;GCC(N)4NGGC（四）限制酶的应用及影响因素1.限制酶的应用重组DNA技术、基因组DNA物理图谱绘制、基因

7、组DNA同源性研究、切割基因组DNA或cDNA构建基因组文库或cDNA文库等。2.影响限制酶作用的因素DNA纯度、结构及甲基度程度；酶切反应的温度、时间及缓冲液体系等。*18只能封闭DNA链上的缺口（nick）,而不能封闭裂口（gap）。是一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶。二、DNA连接酶(DNAligase)——基因工程的缝纫针----“接”需要在一条DNA链的3末端具有游离的羟基、另一条DNA链的5末端有磷酸基团，而且反应过程需要由ATP提供能量。*191.T4DNA