DNA重组及重组DNA技术(一)

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1、掌握：基因芯片、蛋白质芯片、基因文库的概念；※酵母双杂交技术、※标签蛋白沉淀原理及应用；△染色质免疫沉淀技术的基本原理及应用。了解：基因芯片和蛋白质芯片的基本原理、EMSA基本原理。标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。标签融合蛋白沉淀实验流程示意图GST:谷胱甘肽S-转移酶酵母转录激活因子GAL4的结构DNA结合域(b

2、indingdomain,BD)转录激活域(activationdomain,AD)GAL4（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途猎物DNARecombinationandRecombinantDNAtechnology第二十一章DNA重组和重组DNA技术掌握：△同源重组、接合、转化、转导的基本概念；重组DNA技术（基因工程，DNA克隆）※II型限制性核酸内切酶；※载体※基因工程操作过程：分、选、接、转、筛；真核表达体系常用的受体细胞和转染方法；△原核表达体系的缺点。了解：特异位

3、点的重组；转座重组；基因工程技术在医学中的应用。DNA重组（DNArecombination）是指不同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。第一节自然界DNA重组和基因转移DNARecombinationandGeneTransferinNatureDNA重组同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)转座重组(transpositionrecombination)接合作用(conjugat

4、ion)转化作用(transformation)转导作用(transduction)原核生物发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组（generalrecombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型一、同源重组是最基本的DNA重组方式同源重组在DNA损伤修复中的作用同源重组产生的染色质片段交换减数分裂中的同源重

5、组安吉丽娜·朱莉于2013年5月14日公布自己已经接受预防性双乳腺切除手术。朱莉透露做出如此重大的决定的原因：她的母亲与乳腺癌抗争多年，仍不幸在56岁病逝。而她经检测发现自己与母亲一样都存在基因BRCA1/2突变，患乳腺癌的几率高达87%，因而选择了预防性切除手术。1964年提出Holliday模型分支移动Holliday连接体Holliday模型的4个关键步骤：两个同源染色体DNA排列整齐；片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)一个DNA的一条链断裂、并与

6、另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：※内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holliday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´Holliday中间体5´3´5´3´5´

7、3´5´3´5´5´3´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶拼接重组体片段重组体片段重组体切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。Holliday模型的4个关键步骤：两个同源染色体DNA排列整齐；片段重组体(patchrec

8、ombinant)拼接重组体(splicerecombinant)一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：※参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最关键的是RecA蛋白、RecBCD复合物和RuvC蛋白。RecBCD复合物具有三种