分子生物学--定点诱变与蛋白质工程

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1、第九章定点诱变与蛋白质工程山东大学医学院生物化学与分子生物学研究所刘贤锡蛋白质在生命现象中具有重要作用，在医药、轻工等行业也具有重要作用，如胰岛素、枯草杆菌蛋白酶等；天然生物材料中蛋白质含量较少；基因克隆技术克隆基因，在宿主细胞中可表达特定蛋白质（重组蛋白）；多数天然蛋白质的理化特性不能适应于工业用途;利用现代分子生物学技术，改变克隆基因中的特定基因，即可表达出适合于商业用途的蛋白质。在体外，通过碱基取代、插入或缺失的方法，使基因DNA序列中的某个特定碱基发生改变，从而改变蛋白质的结构，称为蛋白质工程。通过蛋

2、白质工程，人们可以随心所欲地改变蛋白质的结构及其理化性质和生物学功能。例如，我们可以利用蛋白质工程改变酶的Km、Vmax，酶促反应的最适温度、最适pH值、酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。蛋白质工程的主要技术之一是定点诱变技术.第一节定点诱变一、定点诱变的概念利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入或缺失可以使基因DNA序列中任何一个特定的碱基发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术，称谓定点诱变（sitedirectedmutagenesis）。定点诱变具有简单易行、重复性高等优点，现已发展成为基

3、因操作的一种技术。这种技术不仅适用于基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质。二、基因定点诱变的意义用于研究基因的结构与功能；通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，使其更符合人们的需要。如酶蛋白的改造以及新型疫苗或药物的开发。如枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的丝氨酸(Ser221)邻近的甲硫氨酸(Met222)易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。枯草杆菌蛋白酶可作为洗

4、涤剂的添加剂，但由于其只能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，底物作用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带正电荷的赖氨酸(Lys)取代位于活性中心166位的甘氨酸(Gly)，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸谷氨酸(Glu)所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点诱变改变蛋白质生物学活性的成功例子。N端-----------笨丙-天冬-----------谷-甘--------------C端多肽链三、定点诱变的原理定

5、点诱变原理示意图TheNobelPrizeinChemistry1993"forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-basedchemistry""forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method""forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesis

6、anditsdevelopmentforproteinstudies"KaryB.Mullis1/2oftheprizeUSA1/2oftheprizeCanadaMichaelSmith四、定点诱变的常用方法（一）M13DNA寡核苷酸诱变基因工程中,噬菌体是一种常用的基因载体,其中又以M13和λ为最常用。M13噬菌体是一种环形DNA，基因组大小为6.4kb，在颗粒中包装的仅是正链的DNA，有时也称为感染型单链DNA(singlestrandedDNA,ssDNA)。当感染型单链M13噬菌体感染大肠杆菌后，在

7、菌体内借助宿主的酶系统先把ssDNA复制为双链（dsDNA），称为复制型（replicationform,RF）M13（RF-M13）。广泛用于DNA序列分析和噬菌体表面展示系统（phagedisplay)和单链核酸的制备。单链丝状噬菌体(M13噬菌体)1.基本原理：寡核苷酸定点诱变技术所依据的原理是:首先制备单链核酸,即按体外DNA重组技术，将待诱变的目的基因插入到M13噬菌体上，制备此种含有目的基因的M13单链DNA，即正链DNA。再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，启动M13单链DNA分

8、子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分。因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列,将其转入细胞后,经过不断复制,即可获得突变的DNA分子,再经表达即可获得改造后蛋白质.为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补。2.诱变过程1)合成含有目的基因的正链DNA；2)合成含有特殊突变碱基的引