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《环状定点诱变技术在单碱基定点诱变中应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、环状定点诱变技术在单碱基定点诱变中应用[摘要]目的采用环状定点诱变技术将重组真核表达质粒pcDNA3.1-hTSHR中hTSHRcDNA序列上发生突变的单碱基诱变回正常的序列。方法设计1对含预期突变的完全互补的诱变引物,以环状质粒为模板进行PCR扩增,得到带缺口的突变质粒,酶消化去除模板质粒,将PCR产物转化DH5α感受态细胞进行缺口修复和克隆。结果DNA测序表明,在预期位点已成功发生诱变,且目的基因其他部位的碱基序列均未发生随机突变。结论环状定点诱变技术是一种高效、简便、快捷的诱变方法,通过该方法成功实现
2、了目的碱基的定点诱变,为后续研究奠定了基础。[关键词]环状定点突变;聚合酶链反应;质粒;人促甲状腺激素受体[中图分类号]Q754[文献标识码]A[文章编号]1671-7562(2009)05-0321-04采用体外细胞生物法来检测自身免疫性甲状腺疾病(autoimmunethyroiddiseases,AITD)患者体内的促甲状腺激素受体抗体(TSHreceptorantibodies,TRAb)时,需要应用表达人促甲状腺激素受体(humanthyroidstimulatinghormone8recepto
3、r,hTSHR)的细胞株。国内目前尚没有此类细胞株供应,鉴于此,本课题组尝试进行了这方面的研究,前期在构建pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达质粒时,通过DNA测序发现目的基因hTSHRcDNA序列上第256位碱基发生了突变,因此本实验拟采用环状诱变PCR法对该碱基进行诱变,以期获得序列完全正确的重组真核表达质粒。1材料与方法1.1材料Muta-directTM定点突变试剂盒购自北京赛百盛生物工程公司,DH5α感受态细胞、DNA分子质量标准及质粒抽提纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,pcDNA
4、3.1-hTSHR(-256C)重组真核表达载体为本课题组前期所构建,限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ为日本TaKaRa公司产品,胰蛋白胨、酵母提取物为英国Oxoid公司产品,引物由上海生工生物工程技术有限公司合成,其余为国产分析纯。1.2引物设计基本原则:上、下游引物互补,延伸方向相反,均携带突变位点,且确保突变位点在引物的中央位置;长度为25～45bp,最好30～35bp;退火温度不低于78℃;GC含量大于40%;最好使用经过纯化的引物。根据上述原则,采用MutaPrimer软件得到如下引物(下划线字母为
5、突变碱基):上游引物,5′-CTACGTATCTATAGATGTGACTCTGCAGCAGCTGG-3′;下游引物,5′-CCAGCTGCTGCAGAGTCACATCTATAGATA8CGTAG-3′。1.3PCR扩增反应反应体系为50μl,按次序加入10×反应缓冲液5μl,质粒DNA模板2μl(约20ng),上、下游引物(10pmol•μl-1)各1μl,dNTPmix(2.5mmol•L-1)2μl,ddH�2O38μl,Muta-directTMDNA聚合酶1μl。反应条件:9
6、5℃预变性30s;然后95℃变性30s,55℃退火1min,72℃延伸9min,共15个循环;最后72℃保温10min。扩增反应完成后将产物冰浴5min,然后置于室温。1.4模板质粒的去除在上述PCR反应产物中加入1μlMutazymeTM酶(10U•μl-1)于37℃温育1.2h,以除去模板质粒。该步骤的原理是MutazymeTM酶能降解甲基化或半甲基化的模板质粒DNA,而PCR扩增的新质粒DNA没有甲基化,因此不会被降解,从而净化了突变的双链DNA。1.5转化将10μl上述经酶切处理过的PC
7、R产物加入到100μlDH5α感受态细胞悬液中,混匀后冰浴30min,42℃热休克90s后立即冰浴2min,加入900μl不含抗生素的无菌LB培养液,37℃振荡培养45min(150r•min-1)。取100μl转化后的菌液均匀涂布于含1008μg•ml-1氨苄青霉素的LB固体琼脂平板上,37℃培养16h。挑取单克隆菌落并接种到5ml含100μg•ml-1氨苄青霉素的LB培养液中,37℃振荡培养16h(250r•min-1)。按质粒抽提试剂盒说明书提取质粒。1
8、.6鉴定将扩增后的菌液送上海生工生物工程技术有限公司,对目的基因的全部碱基序列进行测定,并采用Blast比对软件进行鉴定。用限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ双酶切突变后的重组质粒,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。2结果2.1重组点突变质粒的酶切鉴定克隆到pcDNA3.1中的hTSHRcDNA片段长度约为2.3kb,pcDNA3.1的片段长度约为5.5kb。所提取的突变后重组质粒经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后,在1%琼脂糖凝胶
