《吸附层析》PPT课件

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1、第三章吸附层析第一节概述一、基本概念和色谱过程1、概念色谱法(Chromatography），也称色层法或层析法。此种方法基于混合液中各组分的分子极性、分子大小与形状、吸附力、亲和力等物理化学性质的差异，导致各组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，组分在两相间进行连续多次分配，从而彼此分离。色谱不只是分离技术，也是一种分析方法。2、色谱过程3、色谱方法的共同特点：①色谱分离体系都有流动相和固定相两个相。②色谱过程中，流动相对固定相作连续的相对运动。③被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。4、样品在分离

2、时的两个基本点：①混合物中不同组分在柱内的差速迁移②同种组分在色谱体系迁移过程中分子分布离散二、色谱法分类1、按两相物理状态分类：用气体作流动相—气相色谱用液体作流动相—液相色谱固定相可以是液体或固体，便可组合成四种主要色谱类型：气－固色谱（gas-solidchromatography,GSC）气－液色谱（gas-liquidchromatography,GLC）液－固色谱（liquid-solidchromatography,LSC)液－液色谱（liquid-liquidchromatography,LLC2、按固定相的形态分类（1）柱层析(colu

3、mnchromatography)固定相装在柱内即为层析柱，根据层析柱的尺寸，结构和制备方法不同，分为填充柱层析和毛细管或开管柱层析。（2）平板层析(planarchromatography)固定相呈平板状，包括薄层层析、薄膜层析和纸层析。固定相以均匀薄层涂敷在玻璃板、塑料板或有机薄膜上，或将固定相直接制成薄板状，称为薄层层析(TLC)；用滤纸作为固定相或固定相载体的层析为纸层析(PC)。3、按分离过程物理化学原理分类（1）吸附层析(absorptionchromatography)用固体吸附剂作层析的固定相，利用样品各组分在吸附剂上吸附力的大小不同，而

4、将各组分分离。如气－固吸附层析和液－固吸附层析。（2）分配层析(partitionchromatography)用液体作固定相，样品组分（溶质）在固定相中溶解、吸附或吸着能力不同，因而在两相之间分配系数不同将样品组分分离。如气－液分配层析，液－液分配层析。在液－液分配层析中，根据流动相和固定相对极性不同，又分为正相层析和反相层析。正相分配层析（NPC)一般以强极性、亲水性物质或溶液为固定相，非极性、弱极性或亲脂性溶剂为流动相，称正相层析。反相分配层析（RPC)以非极性、亲脂性物质或溶液为固定相，以极性、亲水性溶剂或水溶液为流动相，称反相层析。（3）离子交

5、换层析ion-exchangechromatography（4）凝胶层析gelchromatography（5）亲和层析affinitychromatography三、层析法的优点生物大分子的特点：有多样性，以复杂的形式（混合物、复合物）存在，对环境如温度、pH条件、离子强度的要求较高。用于研究的样品要求：一定的质和量，保存生物活性和严格的构象。层析法的优点1、在室温下操作2、流动相的pH值可以与生理液相似选用含盐的缓冲溶液或与水互溶的有机溶剂3、柱填料的表面经各种相应化学修饰和覆盖，为生物大分子的分离提供了温和的条件和“软接触”，利于保持其原有的构象和

6、生理活性。4、样品量可多可少，可用于制备和分析。第二节吸附柱层析一、常用术语1.固定相：层析基质2.流动相：洗脱剂、展层剂3.层析：样品在固定相和流动相中连续多次进行分配、吸附或交换作用，最终使各组分得到分离。4.操作容量：在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。一般以每克基质结合某种成分的mmol数或mg数表示。固定相流动相5.床体积：膨胀后基质在层析柱中所占有的体积（Vt）。6.洗脱体积：某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现，浓度达到最大值时流动相的体积。7.膨胀度：单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积（Vβ）。8.分

7、配系数和迁移率K＝在固定相中的含量在流动相中的含量Rf＝在固定相中移动的距离在流动相中移动的距离外水体积Vo洗脱体积Ve固定相层析床床体积＝外水体积＋基质体积＋内水体积Vt＝Vo＋Vg＋Vi二、基本原理生物大分子在层析柱中与吸附剂颗粒的表面吸附位点以范德华引力、静电引力进行可逆性结合,在洗脱剂（流动相）的作用下，通过吸附－解吸附－再吸附－再解吸附的连续历程，依据各成份与吸附剂结合力之间的差异而达到分离。影响吸附层析分离效果的因素吸附剂的性质洗脱剂的性质层析柱及装填技术对样品的要求加样方式及加样量柱效三、吸附剂的选择①选择性好对不同物质的吸附力差异性大②表

8、面积大增加吸附容量③性质稳定不与被分离物、洗脱剂及溶剂发生化学反应；不分解不破坏