实验5-琥珀酸脱氢酶AL

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1、琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制生物化学与分子生物学系陈园园实验7了解琥珀酸脱氢酶的作用及酶促反应中的竞争性抑制作用实验目的竞争性抑制作用抑制剂和底物的结构相似，能和酶的底物分子竞争与酶的活性中心相结合，从而阻碍酶与底物结合形成中间产物。酶活性位点抑制程度取决于抑制剂和底物对酶的相对亲和力以及抑制剂和底物浓度比。加大底物浓度可减弱甚至解除抑制作用。实验原理延胡索酸琥珀酸还原型甲烯蓝(白)琥珀酸脱氢酶甲烯蓝(蓝)E+SESE+P琥珀酸丙二酸E+IEI琥珀酸脱氢酶FADFADH2操作步骤1、酶提取液的制备1~1.3g

2、兔肌肉(剪碎)＋海砂少许(1/3匙)+2ml磷酸盐缓冲液(1/15mol/L)，研磨成糊状，然后再加10ml磷酸盐缓冲液(1/15mol/L)混匀。2、纱布过滤（双层）3、取小试管五只，按书上P40表格加入各试剂。最后加石蜡隔绝空气，37℃水浴保温。每间隔10~15min观察一次结果，并记录。实验结果编号12345酶有有有有无底物+++++++++++++抑制剂-+++++++-结果注意事项注意区分肌肉与筋膜；家兔肌肉必须充分剪碎碾磨，海砂不可加太多；12ml缓冲液要分次加入，不可一次性加入；碾磨器械、纱布要及时

3、清洗，纱布要洗干净晾干；滴加试剂时，一定要看清试剂的名称和浓度；滴加液体石蜡时沿着管壁倾斜加入，盖住液面即可；观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝；实验完成后试管要用皂粉清洗。改良Mohum法测定鼠肝谷-丙转氨酶(GPT)活性实验22实验目的掌握GPT活性测定的基本原理熟悉GPT活性测定的具体操作方法了解血清GPT活性测定的临床意义实验原理GPT2,4-二硝基苯丙氨酸丙酮酸-酮戊二酸谷氨酸在520nm波长测定其光密度，与已知浓度的丙酮酸溶液比较，即可计算谷-丙转氨酶的活性丙酮酸二硝基苯（碱性溶液中呈

4、棕色）血清谷-丙转氨酶活性单位在pH7.4、37℃条件下，每毫升肝匀浆与底物保温30min后，每生成2.5g的丙酮酸作为1个谷-丙转氨酶的活性单位，血清中GPT正常值为2-40U/mL。实验步骤标准管法测定酶活性：1、取干燥试管4支，标号测定管对照管标准管空白管2、依次加入试剂，混匀，37℃保温3、呈色反应后，520nm比色测OD值谷丙转氨酶活性单位/mL鼠肝匀浆=?U/ml方法一：以空白管调0，测A测定、A标准、A对照实验结果A测定测定管中生成丙酮酸的质量=———×m标准A标准A对照对照管中生成丙酮酸的质量=

5、———×m标准A标准30min中生成丙酮酸的质量=m测定–m对照A测定-A对照=—————×m标准A标准30min生成丙酮酸的质量1活性单位=————————————·——2.5gV测定方法二：以空白管调0，测A'标准以对照管调0，测A'测定A'测定———×m标准1A'标准活性单位=————————·——(U/ml)2.5gV测定注意事项保温温度和时间要精确，即酶发挥催化作用的环境要一致。2掌握酶活性单位的概念和计算方法3微量移液器的使用分光光度计的使用1.打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热20~30min

6、2.1档（空白管），T模式调100%，显示“Blank”、“100”3.拉杆拉至1.5档，T模式下调0%，显示“0.00”4.换到A模式，拉至2、3、4档，读取各个样品的吸光度拉杆，1-4档样品池读数波长毛面光面1、分清光面、毛面。手应接触毛面，光线从光面通过2、用溶液润洗2-3次，装至2/3至4/5体积3、粗纸吸水、柔纸擦亮光面比色杯ALT测定的临床意义用本法测定血ALT正常值为40U/ml以下肝细胞中ALT最丰富，当肝脏疾病致肝细胞受损时，ALT即大量释放入血液，致使血清中ALT活性增高。测定ALT是检查肝功

7、能的重要指标之一。显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死；中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎；轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。饮酒、油腻饮食、过劳等因素也会导致ALT短暂增高