凝胶过滤及离子交换层析介质

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1、第九章凝胶过滤及离子交换层析介质广州大学生命科学学院柯德森一.凝胶过滤介质凝胶过滤:利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法.其基本原理是含有尺寸大小不同分子的样品进入层析柱后,较大的分子不能通过孔道扩散进入凝胶珠体内部.较小的分子可以通过部分孔道,更小的分子可通过任意孔道扩散进入珠体内部.从而使得小分子移动最慢,中等分子次之,不同分子尺寸的分子先后顺序不同流出层析柱,达到分离的目的.凝胶过滤示意图凝胶装置图色谱峰和分离结果凝胶过滤的优点分离条件温和,蛋白质不易变性,收率高,重现性好.工作范围广,分离分子量的覆盖面大;设备简单,易于操作,周期短,可连续使用多次.

2、色谱柱的重要参数(1)柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因此柱体积又称“床”体积，常用Vt表示。外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，常用Vi表示。不包括固体支持物的体积（Vg）。支持物的体积（Vg）(2)峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用Ve表示。当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液

3、体积为Ve。当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。凝胶过滤的用途脱盐:用于无机盐和生物大分子的分离.上样量大,为凝胶体积的1/4~1/5,流速大于200cm/h分级分离:用于分离分子大小相近的物质通常为大分子物质的分离,必须采用孔径适当、分离范围与分子大小相适应的凝胶，上样量小，仅为床体积的5%~10%。分子量测定理论上柱长加长有利于分离效果的提高，但实际上却对操作不利。体积排阻色谱法的特点标准蛋白相对分子量曲线的制备：选用四种蛋白：醛缩酶、血清白蛋白

4、、碳酸酐酶及抑蛋白酶肽制成的混合标样。考虑流速等因素对保留时间T的影响而选用了内标法、既在混合标样中加入右旋糖酐蓝和酪氨酸作为内标，进样后可同时测的完全排阻和完全进入填料孔的两种内标的保留时间T0和Tt，用分配系数Kd对相对分子量对数作图，从而保证结果有良好的重现性。样品测定:根据样品的保留时间T求出其分配系数Kd，由Kd从标准蛋白相对分子质量曲线上查出相应的lgMr，计算相对分子质量。流动相用作流动相的溶剂必须能溶解试样;与固定相凝胶性质相似，能浸润凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂应能使凝胶溶胀。溶剂的粘度要低，高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果，尤其是具有低扩

5、散系数的高分子量试样。一定的离子强度1)常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节2)用氯化钠作离子剂，疏水作用最小3)pH值不能太低，因为H+会腐蚀不锈钢柱常用的有四氢呋喃、甲苯、邻二氯苯、二氯乙烷、氯仿、苯、二甲基甲酰胺和水等。一般来说，生物化学领域常采用水溶性溶剂，称为凝胶过滤色谱；在合成高分子化学领域，常采用有机溶剂，称为凝胶渗透色谱。四氢呋喃是最常用的流动相，它对样品有良好的溶解性能和低的黏度，并可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀，因此被优先推荐使用。凝胶渗透色谱——示差折光检测器流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率有较大的差别。凝胶过滤色谱——紫外吸收检测器使用在检测波

6、长无紫外吸收的溶剂作流动相。流速蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很重要的因素，一般在低流速下蛋白质分离是比较理想。样品容量进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的分离度。样品的浓度范围一般在0.01%----0.5%.最好是高浓度、小体积、在一般范围内可以得到好的分离效果。蛋白质的样品体积为柱体积的1%---3%比较合适。蛋白质在变性条件下的分离①变性溶剂如6mol/L盐酸胍、8mol/L脲、0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)等有助于精确地确定蛋白质的分子量。②在变性溶剂中，柱的分离范围因此而移到低分子量范围内。凝胶介质应具备的条件介质本身为惰性物质，不与溶质、溶剂

7、分子发生任何作用；应尽量减少介质内含的带电离子基团，以减少特异性吸附，提高蛋白质的收率；介质内孔径大小要分布均匀，即孔径分布较窄。凝胶珠粒大小均匀；均一系数?颗粒粗细?介质要有良好的物理化学稳定性及较高的机械强度，易于消毒。凝胶过滤介质的种类多糖类骨架的介质：纤维素、葡聚糖及琼脂糖等。是目前生化分离中应用最广、数量最多的凝胶过滤介质。特点：亲水性及生物分子相容性缺点：压力降大，不易操作凝胶过滤介质的种类合成大分子骨架的介质：高亲水性，经过共聚反应控制孔径的大小的一类合成骨架。包括聚丙烯酰胺类(FupergitC,德国)，聚乙烯醇类(Toy