凝胶层析介质的应用.doc

《凝胶层析介质的应用.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、凝胶层析介质的应用1.凝胶层析的分离方式凝胶层析按其分离方式，主要可分为组族分离和分级分离两大类型。1.1组族分离：组族分离是将样品中的各组分分成大小不同的两类分子，然后从低分子量物质中分离出高分子量的物质，或者从高分子量物质中除去低分子量物质的一种分离方法。在这种情况下，高分子量的物质完全被凝胶层析介质所排阻，不能扩散进入凝胶颗粒的内部，而随洗脱液流出层析床；小分子量物质则可以扩散进入凝胶颗粒内，洗脱体积几乎相当于床体积。这种被分离物质之间在分配系数上有极为明显的差别，称为组分离、组别分离或组族分离。组族分离常用于生物产品的制备工艺中，如脱盐，即小分子盐与

2、生物大分子的分离，或在生物制品的最后阶段脱除低分子物质的精制工序等。组族分离，只能将样品达到粗分离的目的，只有分子量相差悬殊的物质才能得以分离，分子量相差越大，分离效果越好。这种分离方法的应用范围比较广泛，如在电泳和离子交换层析前工作液的脱盐、样品中缓冲液的替换、蛋白质的脱盐、核酸制备中酚及无机盐等小分子的去除等。由于这种操作具有方便易行、设备简单、蛋白质回收率高且样品稀释度低等优点，长期在制备分离中广泛应用。目前凝胶层析蛋白质脱盐工艺，几乎完全替代了透析法。脱盐工艺中凝胶层析介质的体积通常为样品体积的4~5倍，流速可达200cm/h左右。1.2分级分离：分

3、级分离是将分子大小相近的物质分开，其分辨率要比组族分离高，但有时洗脱曲线之间会产生洗脱峰的重叠。分级分离常用于物质的分析，如分子量的测定，生物制品在精制时也采用分级分离，即为获取高活性部分的生物制品，得到纯品的精制过程。这种方法要使物质完全分离是比较困难的，受到多种因素的影响。选择适当的分离介质尤为重要，必须采用孔径适当、分离范围与分子大小相适应的凝胶介质。在操作方面，样品的上样量较少，仅为床体积的5%~10%，因此这种分离常用于经过浓缩后的样品。把分离柱加长，可提高分离效果，但会增加床的压力降，减低流速。组族分离和分级分离二者不但在应用方面有区别，在操作方

4、面也有所不同。组族分离的上样量较大，分离容量大，但分辨率低；而分级分离的上样量少，分离容量小，但分辨率高。但是，这二者之间并没有截然的区别。除脱盐及分级分离外，凝胶层析还适用于变性蛋白质的复性及中草药有效成分提取分离等工艺，也可进行多肽、蛋白质、核酸及其它大分子物质分子量的测定及缓冲液的置换。2.凝胶层析介质的选择2.1类型的选择：在进行组族分离时，因为被分离物质的分子量差距较大，因此易于选择凝胶。通常选用孔径小、排阻极限小的凝胶。由于凝胶层析介质的孔隙小，盐等小分子可以扩散进入凝胶颗粒内部，而大分子不能扩散进入，沿液体的流动方向从柱中流出，达到分离的目的。

5、对于分级分离，凝胶的选择非常重要，因为被分离物质的分子量接近，要根据被分离物质的分子量及各种凝胶的选择性特性曲线进行选择。一般先选择排阻极限较低的凝胶，这类介质由于孔径小，珠体的刚性较强，流速可以有较大的选择范围，有利于操作，使被分离物质的洗脱较快，且活性物质的活性回收率较高。若是在水溶液中操作，则选择亲水性的介质；若是在疏水性的有机溶剂中进行分离，则必须选用疏水性的介质。2.2型号的选择：在组族分离时，凝集介质的选择比较容易，因为要分离的两类组分在分子量上又很大的差异，因而容易进行完全地分辨。应选择分子量在排阻极限以上的凝胶介质，是大分子量的物质不扩散进入

6、凝胶内部，在外水体积时洗脱，这样区带的扩散和稀释程度最小，并能减少目标产物留在柱上的时间。脱盐工艺中常选用中等粒径的葡聚糖凝胶。相对分子质量低至5000的目标产物组分需要脱盐时，都可以选用它。这类凝胶介质具有较好的刚性、优良的通透性及较好的流速。对于分级分离而言，选择凝胶介质是一项重要的工作，因为需要分离的物质是一系列分子量接近的成分。选择时需要考虑被分离物质的分子量与凝胶介质的选择性曲线，即必须考虑凝胶介质的分离范围，如果凝胶介质选择不当，会使几种被分离的物质几乎同时从柱中流出，或可以同时在凝胶介质的孔中扩散，而得到的分离谱图的洗脱峰都在外水峰中，或洗脱峰

7、重叠，达不到分离的目的。如果在分离中需要使用解离剂或洗涤剂时，凝胶介质的选择更应注意，要考虑到它们对被分离分子的构型所产生的影响。因为用一些洗涤剂作为助溶剂对一些水溶性较低的膜蛋白组分尤为合适，但对蛋白质的构型有一定的影响，因此要选用孔径更大一些的凝胶介质较为合适。由于各种凝胶介质的分类范围有时会部分重叠，对一些目标产物可选用的分离介质也可能不止一种。这时通常可选择排阻极限较低的凝胶介质，以使目标产物洗脱较快，还有可能提高目标产物的活性回收。此外，对于化学结构相同的凝胶介质，低排阻极限者往往有更佳的刚性，应用时可在较大的范围内选择流速，有利于生产效率的提高。

8、2.3粒径的选择：介质的粒径要根据具体的实验情况而选