(生物技术制药)4抗体工程制药（3噬菌体抗体工程）

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1、第四节噬菌体抗体工程一、噬菌体展示技术基本原理抗体库技术抗体库——在原核系统功能性表达多样性抗体基因(repertoire)通过多种选择手段筛选出特定性能的抗体基因抗体库技术产生的三项技术基础RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因噬菌体展示技术（phagedisplay)抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达一、基本原理模拟体内B细胞产生抗体的过程可绕过免疫直接制备全人源性抗体接头DNAVHVL噬菌体表面呈现的小分子抗体基因III或基因VIII外壳蛋白VHVL抗体库的构建抗体库的富集筛选二、噬菌体抗体库（一）噬菌体抗体库种类1.天然抗体库：来源于未经免疫的

2、供体。代表天然抗体在供体内的抗体谱，亲和力低2.免疫抗体库：来源于经免疫的供体。亲和力高，多样性低3.半合成抗体库：CDR1和CDR2来自人胚系，CDR3随机合成。库容大，亲和力低。4.合成抗体库：VH和VL基因合成VHPoolVLPoolscFvPool105DNASequences105DNASequencesRandomlyLigateCombinatorial（二）噬菌体抗体库的表达载体1.lamda噬菌体2.丝状噬菌体3.噬菌粒一、抗体库技术1.获取目的基因：RT-PCR2.抗体库技术的载体：噬菌粒（phagemid）载体3.淘筛（pannin

3、g）：用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，淘汰非目的克隆，使目的克隆大量扩增。4.表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用Westernblot分析确定后，就完成了全过程。（三）噬菌体抗体库的构建方法PhageDisplayofFabToOptimizeAntibodiesGeneIIICH1VHCLVLVLVHGeneIIIExpressionPlasmid-“Phagemid”EscherichiacoliPeptideDisplayNewEnglandBiolabsPhDSystemE.coli109differ

4、ent7-merpeptidesCa.100copieseach/assay设计VH/VL或L链/Fd链基因上、下游引物进行RT-PCR将PCR产物VH/VL或L链/Fd链重组到粘粒或杆状噬菌体载体中建立文库近年来PCR技术的发展简化了获取可变区基因的过程，用5′端前导顺序或框架区引物及3′端恒定区域V基因中的J区引物，可以从很少量的细胞中扩增得到可变区片段，PCR产物能直接克隆到表达载体上。通常针对不同的VH和VL家族采用不同的引物。109differentphagef1oriAmprRE1(xxxn)RE2geneVIII(xxx)nPhage-di

5、splayedPeptideLibrarySelectionFromLibraryofRandomMutantsRandomLibraryofDNASequencesGene3or8+Gene3FusionsEachPhageDisplaysOnePeptideSequenceTranslatedfromDNAtoPeptideinE.coli筛选（1）表位筛选纯抗原筛选全细胞或裂解液进行筛选（2）功能性筛选：生物学功能，如抗体酶（3）选择性感染筛选：噬菌体感染能力的恢复1.固相或液相纯抗原的筛选、2.全细胞筛选、3.切片组织筛选E.coliSequen

6、ceFusionDNAReplicateAmplify“Winners”InfectPurify噬菌体表面展示文库技术的要点:外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因g3或g8的先导系列的紧靠下游随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后

7、，转入大肠杆菌，三、噬菌体抗体库技术的特点及应用1、建立具有相当容量的抗体库：组合库2、避开了人工免疫和杂交瘤技术：抗体库的大容量和极高的筛选效率，可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术。3、适合工业化生产：用细菌操作4、模拟天然全套抗体库：1011库容，包含B细胞全部克隆。来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录的cDNA扩增，是人体多克隆细胞的总mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性。5、抗体表型与基因型一致6、筛选后

8、得到的人源化可变区抗体，无异种蛋白反应可获得高亲和力的人源化抗体：在噬菌体抗体库