蛋白质分分离纯化和表征1

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1、1蛋白质的分离、纯化和表征第7章P291一、蛋白质的酸碱性质蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是具有两性解离性质的化合物。各种解离基团的解离度与溶液的pH有关，pH越低，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高，则解离情况相反。在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零，这一pH称为该蛋白质的等电点（pI）。蛋白质的等电点有中性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可与蛋白质某些可解离基团结合，影响等电点。无盐类干扰

2、时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液pH称为等离子点(isoionicpoint,或称等离点)。等离子点是每种蛋白质的一个特征常数。几种蛋白质等电点二、蛋白质的分子大小与分子量的测定蛋白质的分子量的范围:6×103～1×106Da（一）根据化学组成测定最低相对分子量用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%,计算二者的相对分子质量

3、。最低相对分子量＝x100=铁的百分含量铁的原子量0.33555.8x100=16700测定蛋白质相对分子量的原理和方法也可以利用蛋白质中含量特少的aa，用同样的原理计算蛋白质的最低分子量。（二）渗透压法测定相对分子量渗透压法测定Mr操作简单，Mr在10-100kDa时较准，但不能区别蛋白质分子是否均一。渗透压公式：Mr=RTlimc→0πc(c=质量浓度，g/mol)（三）沉降分析测定Mr超速离心机最大转速:60000～80000r/min,相当于位于距转轴中心10cm处、单位质量(1g)分子所受到的离

4、心力(离心场强度)为400000×g～700000×g.沉降速度与蛋白质分子大小、密度和形状有关,且与溶剂密度和黏度有关.单位离心场强度的沉降速度称为沉降系数,用s(小写)表示:蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数介于1×10－13到200×10－13秒之间。为了使用方便，以10－13秒为一个沉降系数的单位，称为斯维得贝格单位（Svedbergunit），或称沉降系数单位，用S表示。如人血红蛋白的S为4.46×10－13秒，即4.46S。蛋白质的沉降系数(s)与相对分子质量(Mr)的关系可用斯维得贝格方

5、程表达:摩尔气体常数(8.314J·K-1·mol-1);热力学温度(K),旧称绝对温度蛋白质的扩散系数(cm2/s),数值上等于当浓度梯度为1个单位时在1s内通过1cm2面积的蛋白质质量溶剂的密度(g/cm3)偏微比体积(cm3/g)又称偏微比容,蛋白质溶于水的偏微比容约0.74cm3/g沉降系数（四）凝胶过滤法测定Mr凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，同时可以测定蛋白质分子量。蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:先测得几种标准蛋白质的Ve（Ve为洗脱体积），并以其分子量

6、对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。LogMABCLogM测V测（五）SDS-PAGE法测定Mr聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁

7、移率推算出蛋白质的分子量。SDS破坏蛋白氢键和疏水相互作用,巯基乙醇能打开二硫键,SDS和巯基乙醇存在下,单体蛋白或亚基(寡聚蛋白质解离成亚基)处展开状态.SDS烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体.在一定条件下,SDS与大多数蛋白质的结合比:1.4gSDS/1g蛋白质,相当于每两分子氨基酸残基结合一分子SDS.SDS与蛋白质结合后:第一,SDS阴离子使多肽链覆盖上相同密度的负电荷,远超过蛋白质原有电荷量,掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别;第二,改变蛋白质的天然构象,使大多数蛋白质采取类似的形状.因

8、此在SDS存在下的电泳几乎是完全基于相对分子质量分离蛋白质的.聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）SDS-PAGE，迁移率不受蛋白质原有的电荷、分子形状等因素影响,但凝胶具分子筛效应.因此，迁移率与相对分子质量(Mr)之关系:常数相对迁移率：样品迁移距离/前沿(染料)蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素：双电层水化层三、胶体性质与蛋白质的沉淀1．蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围(1-100nm)。又