蛋白质的分离纯化和表征-教学用

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1、蛋白质的通性、纯化和表征第6章一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定教学内容一、蛋白质的酸碱性质对某种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH，蛋白质的等电点。蛋白质的等电点有中性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可与蛋白质某些可解离基团结合，影响等电点。无盐类干扰时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来的质子数与它的质子受体

2、基团结合的质子数相等时的溶液pH称为等离子点(isoionicpoint,或称等离点)。等离子点是每种蛋白质的一个特征常数。一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定教学内容二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀(一)蛋白质胶体性质(二)蛋白质沉淀分散相质点在1～l00nm范围内,在动力学上是稳定的,介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零,使它能在介质中作不断的布朗运动;分散相质点带有同种符号的净电荷,互相排斥,不易聚集成大颗

3、粒而沉淀;分散相质点能与溶剂形成溶剂化层,例如与水形成水化层,质点有了水化层,相互间不易靠拢而聚集.(一)蛋白质胶体性质分散相质点在胶体系统中保持稳定的3个条件:蛋白质溶液,稳定的亲水胶体:亲水基团与水发生水化作用；某一pH下相同电荷。也有丁大尔现象、布朗运动以及不能透过半透膜性质蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关,影响这些条件的因素都会影响蛋白质溶液的稳定性：加人脱水剂以除去它的水化层；改变溶液的pH达到蛋白质等电点使质点的净电荷为零，蛋白质分子则聚集成大的颗粒而沉淀。(二)蛋白质沉淀沉淀蛋白质的方法有以下几种:盐析法：中性盐(硫酸铵

4、、硫酸钠或氯化钠等)，脱去水化层而聚集沉淀，蛋白质不变性。有机溶剂沉淀法：脱去水化层、降低介电常数增加异性电荷间的相互作用，蛋白质变性。低温操作，且尽量缩短处理时间则可使变性速度减慢。重金属盐沉淀法：带负电荷时易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。可口服大量牛奶或豆浆等可解重金属盐中毒。生物碱试剂和某些酸沉淀法：蛋白质带正电合适与之结合沉淀。加热变性沉淀法：加热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加热凝固一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的

5、含量测定与纯度鉴定教学内容三、蛋白质分离纯化的一般原则(1)前处理:(2)粗分级分离:(3)细分级分离:蛋白质纯化测总目标：增加纯度或比活力动物材料剔除结缔组织、脂肪组织;种子材料应先去壳和种皮以免受单宁等物质的污染,油料种子脱脂.选择适当方法,破碎组织或细胞：动物组织(电动捣碎机或匀浆器或超声);植物组织(英砂或玻璃粉和适当的缓冲液研磨或用纤维素酶);细菌细胞(超声,与砂研磨或溶菌酶).选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来.如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的,用超声波或去污剂使膜结构解聚,用适当的介质提取。(1)前处理:(2)粗分级分离:常用

6、盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，有时可用超过滤或凝胶过滤等方法。(3)细分级分离:各种层析、电泳巧妙配合,后期可用结晶法。一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定教学内容四、蛋白质的分离纯化方法根据分子大小不同利用溶解度差别根据电荷不同利用选择性吸附利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法(一)透析和超过滤(二)凝胶过滤(三)盐溶和盐析(四)有机溶剂分级分离法(五)凝胶电泳和等电聚焦(六)离子交换层析(七)亲和

7、层析(八)高效液相层析常用凝胶：交联葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖（sepharose或Bio-GelA）；凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外，即分级分离范围或排阻极限;大分子从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小。小分子在颗粒网状结构洗脱历程长，后洗脱下来，洗脱体积大；用洗脱体积同标准分子量的蛋白质的比例关系测定蛋白质分子量；(二)凝胶过滤凝胶过滤层析、大小排阻层析或凝胶渗透层析Vt:柱床总体积，常称柱床体积；V0：为孔隙体积或外水体积，测出不被凝胶滞留的蓝色葡聚糖-2000的洗脱体积即为V0;Vi：内水体积，凝胶珠

8、内部的水相体积；Vm：为凝胶基质体积；Vt=V0+Vi+VmVe某一待分离物质组分的洗脱体积,自加样品开始到