基因克隆 操作步骤原理及注意事项

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1、一：提质粒1：提取ml的菌液放到EP管中，12000r/s30s离心，去除菌液，加入100微升的TE振荡混匀后加入200微升裂解液二，轻轻混匀，是使细胞破碎，同时使蛋白变性和保持其高碱性，再加入150裂解液三轻轻混匀是鞋包裂解开（最佳的效果是上层是蛋白，下层是透明的液体），离心10min，将液体转移到另一个EP管中，加入等体积的异丙醇，静置10min或更长（一般以析出的DNA为主蛋白次之），离心10min12000rpm/s，除去上清液，加入400微升的70%的乙醇洗（去除里面的有机溶剂，同时使DNA沉淀），去除乙醇，室温下开口放置5-10min或放到烘箱中使乙

2、醇挥发干，再加入20微升的水，跑胶看浓度溶液I：Tris-Cl控制PH；葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。溶液II：NaOH裂解细胞的作用；SDS主要是变性蛋白，也有溶解细胞的作用。溶液III：3M醋酸钾钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也

3、一起被共沉淀了；2M醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。25/50酚+24/50氯仿+1/50异戊醇的作用：酚抽提蛋白的作用；氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。乙醇---100%沉淀质粒的作用；70%洗质粒去离子的作用；RNase水：消化所提质粒中的RNA。2：消化补到50微升体系，再加入5微升的RNase放入37℃2-3个小时3：抽提加入150微升的TE补到200微升体系加入100微升的氯仿100微升的苯酚充分混匀12000r

4、pm/s10min离心将上层液体转到新EP管中再像其中加入200微升的氯仿充分混匀，12000rpm/s离心，取上层液体到新EP管中，加入1/4体积的5mol/L的NaCl两倍体积的无水乙醇，放入-20℃3小时沉降后离心12000rpm/s10min，70%的乙醇洗干，再晾干或烘干加20微升的水跑胶检测补充：酚氯仿法提取DNA的原理用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变

5、性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀D

6、NA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。4：酶切酶切体系：a：鉴定20微升体系Buffer-x2微升酶1微升质粒2微升（依浓度而定）补水到20微升b：回收100微升体系Buffer-x10微升酶-x3-5微升质粒10微升（依浓度而定）补水到100微升注意事项：保持质粒的高浓度，确保回收的量酶切一般3小时37℃5：回收：a：做胶浓度在0.7左右的酶切前先少量点样确定酶切完全，加样100v1小时左右b：先在小烧杯里加水煮沸，将切胶的镊子预热，洗干净，切下所需的条

7、带，放到EP管中c：向EP管中加入400微升的bindingbuffer二，在60℃中融化，3000rpm/s1min重复三次将离心的液体倒回冲洗离心d：去除下清，降入500微升的washingsolution洗两次每次用新的洗液8000rpm/s30s再12000rpm/s2min去除残留的液体e:加入10微升的ElutionBuffer放入37℃培养箱中10min结合12000rpm/s2min注意事项：1：保证是新胶新缓冲液浓度大小合适2：割胶大小要对，割错了后面就白做了，不要割错了条带，这很重要，3：短波紫外线（254）会引起DNA的断裂或是形成TT二聚

8、体，前者会使以后的链接与