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《重组门冬酰胺酶制备表达纯化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、酶类药物--重组门冬酰胺酶Ⅱ表达和制备酶的分类门冬酰胺酶ⅡL -天门冬酰胺酶AnsB能催化天门冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨。淋巴瘤和白血病细胞通常不能合成天门冬酸胺，L -天门冬酸胺酶将阻止癌细胞蛋白质合成而导致癌细胞死亡。在临床上，L -天门冬酰胺酶已广泛用于治疗白血病和淋巴瘤。但目前国内尚不能生产，国外也仅有低产酶能力的大肠杆菌野生株产品，生产成本高，药价昂贵。基因工程菌产品既能填补国内空白，又能大幅度降低生产成本。参 考 文 献1---重组与表达刘景晶，李晶，吴梧桐，胡梅清.《大肠杆菌L-天门冬酰胺酶Ⅱ基因的高效表达》中国药科大学
2、生物化学教研室,南京210009南京铁道医学院生物化学教研室,南京2100092---提取与纯化刘景晶,金健勤,戴海滨,吴梧桐.《大肠杆菌L门冬酸胺酶的提取和纯化》中国药科大学生化教研室,南京210009重组与表达材料限制酶Ncol、Hind III及T4DNA连接酶，购自Promega公司；Taq酶、dNTP、IPTG购自华美公司；丙烯酰胺、N,N’ -甲叉双丙烯酰胺、SDS购自sigma公司。pKK233 -2购自clonetech公司；pKK233 -ansB是将代PCR扩增得到的AnsB基因DNA用Ncol和Hind III消
3、化后，定向插入pKK233 -2的多克隆位点而得到的重组质粒。实 验 方 法PCR扩增AnsB基因重组质粒PKK233-ansB的构建阳性转化子的筛选PCR扩增AnsB基因模板的制备：用接种环挑取CPU210009菌体少许，在裂解液(1﹪TritonX-100,2mmol/LTris-HClpH8.5,2mmol/LEDTA)1ml中振散，95C加热处理液10min,吸取处理液5ul用于PCR。引物：E1:5‘-GGCCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCACITGC一3′E2:5′-GGAAGCTTGAGAATGCCGTG
4、ATAC一3′11：5′-GGCCATGGAGT111TCAAAAAGACGCACTTGC一3′12:5′-GGAAGCTTAGACTGATTGAAGATCTGCTGG一3′扩增条件：84C变性1min;60C复性2min;72C延伸1min；循环28次。重组质粒PKK233-ansB的构建PcR扩增后的DNA片段及质粒pKK233 -2同时分别用限制酶Ncol和Hindl消化并用琼脂搪凝胶电泳分离和回收质粒大片段；将消化后的DNA片段和电泳回收的质粒大片段用T4.DNA连接酶连接，连接产物经琼脂糖凝胶电泳回收后转化HB101、71/
5、15、ATCc9637、JM107、cPU210009，筛选获得相应的阳性转化子。阳性转化子的筛选将涂布在含氨节青霉素的LB平板上生长出的单菌落用牙签逐个挑入方格化的新鲜LB平板上，为每个克隆编号。平板置37C温箱中过夜，待菌落形成后，用灭菌牙签逐个挑取少量菌体，移入预先加有0.1mol/L硼酸缓冲液（pH8.4)50ul的酶标板反应孔内，待菌体分散后，每孔各加入0.04mol/L天门冬酞胺底物溶液50ul,37C保温15min，加奈氏试剂50ul，呈深棕红色孔内对应的单菌落即为阳性转化子。条件选择酶的纯度酶的浓度金属离子pH温度、时
6、间晶种酶的分离纯化工作中的注意事项1.防止酶蛋白变性2.防止复因子丢失3.防止酶被蛋白水解酶降解提 取 纯 化蔗糖溶液提取法L-天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析）酶活力的测定酶分子量测定提取纯化L-天门冬酰胺的提取（蔗糖溶液提取法）向菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖抽提液（蔗糖40﹪，溶菌酶200mg/L,EDTA10mmol/L,pH7.5.）在30C震2小时，8000r/min离心30min,收集上清酶液。L-天冬氨酸酶的纯化蔗糖溶液提取法获得的酶液,加入硫酸铵至55﹪饱和度，调pH至7.0,室温搅拌1小时,离心除去沉淀。上清液中加入硫酸铵
7、到90﹪饱和度，离心收集沉淀。沉淀物用50mmol/L、pH7.0磷酸缓冲液溶解并透析。透析后的酶液通过预先用10mmol/L、pH7.6的磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素DE52层析柱（1.0×30cm）。用30mmol/L磷酸缓冲液洗脱,流速为40ml/h。每分钟收集一定的洗脱液并于280处测定紫外吸收值，绘制洗脱曲线（如图1）Ph4.8,通过预先用50mmol/L,pH4.9磷酸缓冲液平衡的CM-纤维素层析柱（1.0×8.0cm）,用50mmol/L、pH5.2磷酸缓冲液洗脱,收集显示天门冬酞胺酶活力的组分,冻干后得天门冬酰胺冻
8、干粉。再进行称量计算产量。L-天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析）取适量样品加入1%NH4HCO3溶解至1.0mg/ml，按1∶30(W/W)加入胰蛋白酶，37±0.5℃保温16h，50%冰醋酸终止反应备用。色谱条件 流动相：A
