生物技术制药第5章

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1、第五章动物细胞制药第一节概述1665年英国物理学家虎克用自制的显微镜发现了细胞，实际上是死细胞留下的细胞壁，不久，荷兰科学家列文虎克才真正观察到了细胞。从此认为细胞是一切动植物体结构和功能的基本单元。1838年德国的植物学家施莱登和动物学家施旺共同创立了细胞学说。细胞学说所有生物都是由一个或多个细胞组成的；细胞是生命的基本单位；新细胞是由原有细胞分裂而来的。细胞培养是将细胞从机体取出，在体外模拟机体体内生理条件进行培养，使之生存和生长。细胞培养已有近百年历史了。随着细胞生物学、分子生物学、生物化学和基因工程等一系列学科和技术的发

2、展，逐渐形成了细胞工程学。细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品。第二节动物细胞的形态和生理特点一、动物细胞的形态动物细胞属于真核细胞，结构复杂，分化精确，不同细胞执行不同的功能，例如神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激，红细胞呈扁圆盘状，增大其接触面等。但细胞在离体培养时形态会发生变化

3、，根据不同的需要将离体培养的细胞分为三类：贴壁依赖型、贴壁非依赖型和兼性贴壁型。1、贴壁细胞生长时必须要有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长和繁殖。细胞在表面上生长时有两种形态，成纤维样细胞型和上皮样细胞型。成纤维样细胞型主要来源于中胚层组织细胞，如心肌细胞、平滑肌细胞成骨细胞等。上皮样细胞型主要来源于外胚层和内胚层组织细胞，如皮肤细胞、肠管上皮细胞，在培养过程中，随着培养条件的变化细胞形态也会发生改变。贴壁细胞单层培养的优点1、可以很方便地进行完全换液；2、如果需要高细胞密度，可

4、通过灌流技术完成；3、很多细胞只有在贴壁时才能更有效地表达产物；4、可用于所有细胞类型。细胞贴壁的表面处理可以使用三种物质1、玻璃，重复使用贴壁效果会降低，用1mmol/L醋酸镁室温浸泡几个小时，再用蒸馏水反复冲洗可恢复贴壁能力。2、塑料，聚苯乙烯最常用。3、金属，不锈钢或钛，化学特性呈惰性，具有适合的高阴性电量。单层培养的放大1、转瓶；2、改进的转瓶，玻璃管、增大表面积的转瓶；3、单元操作系统，玻璃珠反应器、微载体系统。2、悬浮细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长，如淋巴细胞等。3、兼性贴壁细胞根据生长条件的不同可贴壁

5、也可悬浮生长，中国地鼠卵巢细胞。二、动物细胞生理特点1、分裂期长12-48小时，同一种属不同部位的细胞也不相同，分裂期受培养条件的影响如温度、酸度、成分等。2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。大多数二倍体细胞的生长都需在一定的基质上贴附，伸展后才能生长繁殖，机制并不清楚，当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即细胞与周围细胞接触时，细胞就停止增殖—接触抑制，若细胞转化成异倍体后，该抑制可解除。3、正常二倍体细胞的寿命是有限的。正常二倍体细胞传代培养都是有限的，大约在50代左右，然后细胞就会逐渐死亡，但在培养基中加入表皮

6、生长因子或经自然和人为的因素转为异倍体后该细胞可转变成无限细胞系，更适合于工业生产。4、动物细胞对周围环境十分敏感物理化学因素，如渗透压、酸度、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化都会影响其生长，这是由于动物细胞没有细胞壁的保护，所以更敏感。5、动物细胞对培养基要求很高原核生物只要有碳源、氮源和无机盐就可以生长；而动物细胞不仅需要12种必需氨基酸、8种以上维生素，多种无机盐和微量元素、葡萄糖外，还需要多种细胞生长因子和贴壁因子。6、动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。动物细胞蛋白质的合成在游离和粗面型内质网上都可以进行，

7、内质网上合成的蛋白质多数为糖蛋白，需要糖基化，而细菌细胞则没有糖基化过程。动物细胞作为宿主细胞生产药物的优点和缺点：优点：多半可分泌到细胞外，提取纯化方便，蛋白质经糖基化修饰后与天然产物更一致，适合于临床应用。缺点：培养条件要求高、成本高、产量低。第三节生产用动物细胞的要求和获得一、要求最初要求生产用动物细胞必须是原代细胞，以后放宽至二倍体细胞即可，即使是经过多次传代也可用，但是非二倍体细胞是绝对禁止使用的，因为担心异倍体细胞的核酸会影响到人的正常染色体，有致癌的危险。由于二倍体细胞传代不会超过50代，所以使用受到限制。后来发现

8、异倍体也可使用，并未对机体产生影响，并且可无限使用，对工业生产带来了极大的方便。二、获得原代细胞、已建立的二倍体细胞系及可无限传代的转化细胞系。1、原代细胞直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化后获得的细胞悬液。需大量动物，费钱费劳力。2、二倍体细胞原代细胞经过