10生物技术制药第3章

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1、第三章基因工程制药本章主要内容第一节概述第二节基因工程药物生产的基本过程第三节目的基因的获得第四节基因表达第五节基因工程菌的稳定性第六节基因工程菌生长代谢的特点第七节基因工程菌发酵第八节基因工程药物的质量控制第一节概述生物技术的核心是基因工程，基因工程技术最成功的应用是用于生物治疗的新型生物药物的研制。之前，许多在疾病诊断、治疗和预防中有重要价值的内源性生理活性物质以及某些疫苗：由于材料来源困难或制造技术问题而无法研制出产品;应用传统技术从动物器官中提取，造价太高；因来源困难而供不应求；免疫抗原反应；病毒感染不安全。应用基因工程技术就可以从根本上解决上述问题。

2、它为上述疾病的预防、治疗和诊断提供了新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂。基因工程是利用DNA重组技术在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞，进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生人类需要的基因产物，达到定向地改变生物遗传特性或创造新物种的目的。利用基因工程技术生产药物的优点：1、大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障；2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；4、内源生理活

3、性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。第二节基因工程药物生产的基本过程基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。基因工程的主要操作步骤基因工程药物制造的主要程序目的基因的克隆；构建DNA重组体；将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌；工程菌的发酵；外源基因表达产物的分离纯化；产品的检验等。通常将基因工程药物的生产分为上游和下游技术。上游阶段是研究开发必不可少的基础，它主要是分

4、离目的基因，构建工程菌，在实验室完成。下游阶段是从工程菌的大规模培养到产品的分离纯化、质量控制，该阶段是将实验室成果产业化、商品化。下游下工技术主要包括工程菌大规模培养最佳参数的确定、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造、电子计算机的优化控制等。第三节目的基因的获得对于原核生物，其基因总量不大，可以选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因。对于真核生物不能进行直接分离。真核细胞中基因总量较大，从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难。另外，真核基因一般都有内含子，如果以原核

5、细胞作为表达系统，真核基因转录的mRNA也不能被加工、拼接成为成熟的mRNA，因此不能直接克隆真核基因。内含子是基因内的间隔序列，不出现在成熟的RNA分子中，在转录后通过加工被切除。大多数真核生物的基因都有内含子。需注意的是，在古细菌中也有内含子。在转录后的加工中，从最初的转录产物除去的内部的核苷酸序列。术语内含子也指编码相应RNA内含子的DNA中的区域。大多数真核结构基因中的间插序列（interveningsequence）或不编码序列。它们可以转录，但在基因转录后，由这些间插序列转录的部分（也可用内含子这个术语表示）经加工被从初级转录本中准确除去，才产生有

6、功能的RNA。基因的编码部分称外显子。内含子常比外显子长，且占基因的更大比例。真核基因所含内含子的数目、位置和长度不尽相同，如鸡卵清蛋白基因的外显子被7个内含子隔开，鸡卵伴清蛋白基因有17个内含子，α-珠蛋白基因有2个内含子，卵粘蛋白基因有6个内含子等。又称沉默DNA（silentDNA）。真核基因中的非翻译区，它不被表达于蛋白质分子或成熟的mRNA中。内含子把单个真核基因分成许多不连续的区域。内含子也可见于某些前核基因组，但较为少见，且也有许多调节功能。由核RNA转录产生的为不均一核RNA(hnRNA)含有内含子，经特殊的酶（如ribozyme）作用切去内含

7、子序列，然后剩余的外显子（exon）被连接酶拼接成为成熟的mRNA。内含子和外显子克隆真核基因常用的方法有：逆转录法化学合成法一、逆转录法逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补DNA（cDNA），然后进行互补DNA的克隆表达。该序列不含内含子。互补DNA克隆示意图单链DNA双链DNA1、mRNA的纯化细胞内含有三种RNA，mRNA占RNA总量的2%-5%，相对分子量大小不一致，分离也有很大的困难，但是mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸polyA组成的末端，长达20-250个腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸OligodT-纤维素上，从而可以用亲和

8、层析法（高盐结合，低盐洗脱）将mRNA