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1、PRUE-LAMP检测结核分枝杆菌在中国区县实验室诊断性能评估XichaoOul・，QiangLiL,HuiXiaL,YuPang1,ShengfenWang1,BingZhao1,YuanyuanSong1,YangZhou1,YangZheng1,ZhijianZhang5,ZhiyingZhang2,JunchenLi2,HaiyanDong2,JackZhang2,KaiManKam3,JunyingChi4,ShitongHuan4,DanielP.Chin4*,YanlinZhao1*摘要：背景：能够在早期有效的检测结核分枝杆菌，尤其是涂布阴性的结核病
2、，对全球肺结核防控至关重要。环介导等温扩增法与快速DNA捉取法(PURE-LAMP)相结合，可以高灵敏性、高特异性、快速检测痰液样木中结核分枝杆菌。尽管如此，PURE-LAMP诡缺乏足够的评估，尤其是在资源有限的基层实验室。本研究中，通过对来自中国两个县级实验室肺结核疑似患者进行检测，评估了PURE-LAMP法在基层实验室检测结核分枝杆菌的性能。方法与结果：自2011年4月・2012年2月，收集来自中国两个县级结核病实验室的肺结核疑似患者三种痰液标木(即吋痰，晚间痰和晨痰)用于检测。用标准L・J培养法做对照，结果显示，PURE-LAMP法检测即时痰标本结核分枝杆菌
3、的灵敏度达到70.67%o同时，PURE-LAMP法在基于涂片呈阳性培养阳性，涂片阴性培养阳性的标本中灵敏度分别为92.12%和53.81%。PURE-LAMP法检测即时痰结核分枝杆菌中的特异性为98.32%0基于三种样本检测结核分枝杆菌，PURE-LAMP法的灵敏度和特异性分别为88.80%和96.86%。与固体培养法相比，PURE-ALMP法可显著降低污染率。结论和意义：结果表明，在中国的基层结核病防治实验室检测结核分枝杆菌，PURE-LAMP法具有较高的灵敏度和特异性。其具有高效、快速和安全的优点，值得在基层及偏远地区广泛推广使用。结核病仍然是威胁全世界健康
4、的重大疾病，2012年，据统计新发结核病约860万，死匸人数约130万⑴。快速准确的诊断对结核病有效治疗和防控至关重要23】。目前，全世界范围内结核病常用的诊断方法是涂片镜检，众所周知该方法灵敏度低，特别是对感染HIV的低免疫力病人3】。培养法是结核病诊断的金标准，灵敏度较涂片法高，但培养耗时长（2周周）。为了满足结核病防治快速灵敏的要求，一系列核酸扩增方法不断涌现&冥然而，由于分子检测需要复杂的操作流程和昂贵的仪器，设施简陋、技能缺乏的广大基层实验室尚不能满足这些条件来开展。LAMP法是一种崭新的恒温核酸扩增方法“2】，不需要昂贵的仪器设备。TB-LAMP是日本
5、荣研公司基于LAMP技术开发的结核菌检测试剂盒。它具有的一系列特征为资源缺乏的基层实验室提供了分子检测平台：快速（40mins），恒温（只需加热快）,稳定（对抑制剂和反应条件具有一定的容忍性），检测结果可以直接用肉眼观察判定,，3_151o2007-2010年，荣研公司与FIND基金会合作，成功研发出新一代TB-LAMP检测试剂盒，即PRUE-LAMP,该试剂盒包括一个简单的DNA提取过程[⑹。PRUE-LAMP具有更高的灵敏度和特异性，并重新设计优化了反应引物。DNA的提取和扩增过程都可以在一个封闭的反应管中进行，这样可以有效减少污染风险。PRUE-LAMP包括
6、3个步骤：样本准备（10・20min）,扩增（40min）,直接通过肉眼观察荧光检测结果（0.5-lmin）[17]o为了评估PURE-LAMP的临床性能，我们选择了屮国河南省2个区县级实验室进行实验。材料和方法实验设计本实验在中国河南省两个显微镜检实验室（获嘉县和新乡市）进行。收集2011年4月・2012年2月來自门诊就诊的连续纳入的肺结核疑似患者（连续咳嗽咳痰2周，咳血，伴有血样痰）痰液标本用于研究，每位患者采集3种痰液（即时痰、晚间痰、晨痰），每份痰样量至少2mL（O.lmL用于涂片，ImL用于培养，0.06mL用于PURE-LAMP实验）。每份痰液样本同时
7、进行直接涂片抗酸染色、固体培养和PURE-LAMP实验，中国国家结核病参比实验室（NTRL）的实验员收集所有培养呈阳性菌并进行16S-23SrDNAITS测序分析来鉴别菌种。以固体培养为参照来评估PURE-LAMP性能。本实验Z前，两个镜检实验室均未做过固体培养和PCR实验，为了确保LAMP检测和培养实验质量，所有实验员都在NTRL经过1周的培训。为了确保固体培养质量，新乡和获嘉的工作人员预先进行了9个月的TB培养实验培训。LAMP实验也在当地试验点进行了培训。方法萋-尼染色镜检和罗氏培养：实验员按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》〔网的要求做好实验室涂片镜
8、检的室内和
