尿液结核分枝杆菌检测对肾结核诊断价值

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1、尿液结核分枝杆菌检测对肾结核诊断价值【摘要】目的探讨尿液结核分枝杆菌检测在肾结核诊断中的应用价值。方法对108例已确诊为肾结核的患者尿液标本分别采取抗酸菌涂片染色、改良罗氏培养、荧光定量PCR三种方法进行检测，其结果进行分析。结果抗酸菌涂片染色、改良罗氏培养、荧光定量PCR检测尿液中结核分枝杆菌的阳性率分别为25.9%、51.9%、72.2%。结论尿液结核分枝杆菌检测属病原学检测，特异性好、操作简便，对肾结核的诊断有着重要的应用价值。【关键词】尿液；结核分枝杆菌；肾结核；诊断结核病是全球严重的公共卫生问题之一，据WHO估计,全球有约20亿人感人结核分枝杆菌，每年有约200万人死

2、于结核病［1］。近年来，随着结核病发病率在全球范围内的回升，肾结核的发病率也明显增加。据统计，全球每年有近千万人感染结核病，而肾结核约占其中的8%〜20%。该病进展隐蔽，发现时，肾功能已部分或完全丧失，患者早期诊断困难，以致延误治疗，对人们的身体健康危害极大。因此早诊断对治疗尤为重要。在众多辅助检查中，除病理诊断外，实验室病原学检查具有较高的特异性，且操作简便，患者无痛苦。现就最常用的抗酸菌涂片染色、改良罗氏培养、荧光定量PCR三种检测方法进行分析，评价其在尿液结核分枝杆菌检测对肾结核诊断的应用价值。1资料与方法1.1一般资料2010年11月〜2013年10月本院住院的肾结核患

3、者，共计108例。男性58例，女性50例。其中小于20岁者7例，大于40岁者27例，20〜40岁者74例，占68.5%；单侧肾结核87例，双侧肾结核21例；合并其他脏器结核病（如肺结核、脊柱结核、肠结核、附睾结核等）65例，约占60.2%o1.2标本收集1.2.1抗酸菌涂片染色检测留取12h尿液，静置,倾去上清液，留取沉淀部分30ml,以3000rpm离心30min,弃上清，取沉淀物涂片。1.2.2改良罗氏培养和荧光定量PCR检测嘱患者留取晨尿，因晨尿浓缩，适用于做病原学检查。在留取尿液之前先用消毒液清洗外阴，以去除污染菌。分别留取中段尿约20〜30ml于一次性无菌塑料标本杯中

4、各一杯。为提高检出率，所有患者均连续留取3d标本，置于2〜8*冰箱中贮存，于3d后将尿液混合进行改良罗氏培养和荧光定量PCR检测。如患者正在进行抗结核药物治疗时，应停用所有抗结核药一周，以提高结核杆菌的检出率。1.3试剂与仪器1.3.1抗酸菌涂片染色试剂由珠海贝索生物技术有限公司提供。无需特殊仪器。1.3.2罗氏培养改良酸性罗氏培养基由珠海贝索生物技术有限公司提供。隔水式培养箱由天津市泰斯特仪器有限公司提供。1.3.3荧光定量PCR由中山大学达安基因股份有限公司提供试剂。仪器LightCycler3.5全自动荧光定量基因扩增仪由罗氏公司提供。1.4方法1.4.1抗酸菌涂片染色取

5、制备好的尿沉淀物0.05〜0.10ml均匀涂于玻片上，直径约2〜3cm,火焰固定。滴加石碳酸复红染液布满标本，保持3〜5min。流水自玻片一端冲洗洗去染液，沥干剩余水分。滴加3%的盐酸酒精,1〜3min后流水冲洗沥干。滴加美蓝染液，0.5〜1min后流水冲洗沥干。置于干燥箱中干燥后镜检。1.4.2改良罗氏培养将标本进行离心，以2000rpm/min离心3min为宜，取离心沉淀后的尿沉渣标本0.1〜0.3ml,以无菌操作接种于培养基斜面上，一般每份标本同时接种2支培养管。将接种好的培养管置于35〜37£培养箱中孵育，5%〜10%的C02可以促进分枝杆菌的生长，培养管须松盖倾斜放置

6、24h后再将盖子锁紧，垂直放置。接种并孵育第一周需每天判读一次菌落生长情况。此后每周判读一次，记录菌落生长及污染情况。判读如发现斜面培养基上有菌落出现，须挑取菌落做成涂片进行抗酸染色镜检。1.4.3荧光定量PCR取底部尿液标本10〜15ml离心管中15000rpm离心5min。去上清，沉淀加无菌生理盐水lml打匀，15000rpm离心5min,去上清。加50P1DNA提取液充分混匀，10CTC浴温10min,待自然冷却后，10000rpm离心5min,取上清液2卩1加入专用毛细管中4000rpm离心3min,插入圆形卡盘倒置20s后放入仪器中进行循环扩增。步骤为：93°C-2m

7、in预变性，然后按照93°C5s-57°C45s,做40个循环，最后置37°C延伸1s。整个过程严格执行无菌操作，扩增及结果判读，由电脑自动完成。2结果三种方法检测尿液结核分枝杆菌的阳性检出率分别为抗酸菌涂片染色法25.9%(28/108),改良罗氏培养法51.9%(56/108),荧光定量PCR法72.2%(78/108)。3讨论近年来临床不典型肾结核发病率有增加的趋势[2],此外，超过1/2的肾结核患者伴有全身其他部位的结核菌感染，所以发现全身其他部位的结核病灶时，应进行全面检查是否存在