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1、实验3大蒜浸提液的抑菌实验一、实验冃的1.学习抑菌实验的具休方法。重点：1、最小抑菌浓度、最小杀菌浓度的概念。怎么测定（试管法、微量法）。最小抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentration,MIC）：在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度，用于定量测定体外抗菌活性。最小杀菌浓度（minimumbactericidalconcentration,MBC）:杀死99.9%（降低级3个数最）的供试微牛物所需的最低药物浓度。有些药物的MBC与其MIC非常接近，如氨基糖廿类。有些药物的
2、MBC比MIC人，如B内酰胺类。MIC测定方法：常量肉汤稀释法；微量肉汤稀释法；琼脂稀释法。MBC值的测定：在培养皿（90nmi）中，倒入已融化并冷却至45°C〜50°C左右的固体培养基，待凝固后，収MIC中无细菌生长的两孔各lOOpl,分别进行涂布计数，涂布完成后先将培养血在37°C恒温箱中正放1小时，再翻转培养24〜48h,观察结果。以菌落数不超过5个的平板所对应的孔的最低药物浓度即为该药物的最低杀菌浓度（MBC）。2、倍比稀释的概念。二倍稀释法，即1体积待测样品中加入1体积去离了水或蒸憎水。可以使样品的浓度减少一半这种方法。3、操作注意
3、事项。无菌操作，不能移动，瓶塞不要放桌面上（棉花），纸片间保持距离，纸片要贴紧4、菌种的活化和保存。活化：平板（纯化）和斜面一般保藏的方法有：斜面法4°C（霉菌，放线菌保存3・5个月移种一•次，普通细菌1个月），冷冻真空T燥法，液氮法，甘油保存，液休石蜡法（无菌石蜡加在卜-面lcm,室温或冰箱保存），砂土管法，5、平板法测抑菌直径：纸片法、牛津杯、打孔法。（抑菌效果的初步判断）6・灭菌的几种方式（干热火菌160-170°C,l-2h电热干燥箱，高压蒸汽火菌0.1MPa,121°C,小瓶20min,人瓶30min,紫外火菌200-300nm都有
4、杀菌效果，265-266nm最强，灼烧，过滤除菌0.22pm病毒更小，0.45pm；有机系微孔滤膜、水系微孔滤膜。水系微孔滤膜：适用水溶液，水系，不耐有机溶剂。女II：混合纤维素酯膜，又称混纤膜（WX）膜。有机系微孔滤膜：疏水，适用有机溶液等。女（1：偏氟膜，由聚偏氟乙烯树脂制成，为疏水性滤膜，适用于有机溶剂及空气过滤。而尼龙膜是通用型，满足纯水样品和水/有机混合样品。）二、实验材料大蒜。供试菌种：人肠杆菌、藤黄八叠球菌。三、试剂蛋白丿冻、氯化钠、牛肉膏、琼脂、1molf'氢氧化钠、生理盐水（0.9%）、75%酒精。四、仪器及用具电子精密天平
5、、电炉、立式压力蒸汽灭菌器、洁净工作台、培养箱、离心机、打孔器、游标卡尺、pH试纸（5.5-9.0）、烧杯、玻璃林、胶头滴管、量筒、具塞锥形瓶、封瓶膜、林线、接种环、银子、具塞试管、移液管、培养皿、离心管、滤纸片、枪头、牛津杯、移液枪五、实验步骤5」玻璃器皿等的包扎以及灭菌具塞试管、移液管、培养皿、离心管、滤纸片、枪头、牛津杯、滤纸5.2培养基的配制以及灭菌【称量及溶化】分别称取蛋白月东l・0g和氯化钠0.5g,置于250mL烧杯中，加入60mL左右的蒸锚水，用玻璃棒挑取牛肉膏置于25mL或50mL小烧杯中（或称量纸上），称量0.5g,然后加
6、入少量蒸憎水于该小烧杯中，加热融化，倒入（洗入）上述250mL烧杯中。将此烧杯置于石棉网上加热，用玻璃棒搅拌，使药胡全部溶化。【调pH】待溶液冷至室温时,用1mol-L^NaOH溶液调pH至727.4。【定容】将溶液倒入量筒中，补充水量至lOOmLo【加琼脂】加L5g琼脂，加热融化，补充失水。【分装】分装入2个250mL具塞锥形瓶（一瓶60mL左右大肠，另一瓶40mL藤黄）,分别塞好塞子。【高压蒸汽灭菌】lOOMPa灭菌20min□即（12TC,20min）o5.3菌种活化将试验菌（藤黄八叠球菌、大肠杆菌）从4°C冰箱中取出，分别接种到新鲜斜
7、面培养基中（装有pH7.4的牛肉膏蛋白J］东固体培养基的试管），各2支。37°C恒温培养16・18h,备用。（细菌经37°C/24h,酵母菌、硯菌经28°C/24h恒温培养活化）。已活化好。5.4菌悬液的制备简单染色并镜检来确定菌种有无变界；如无变界，用无菌生理盐水制备菌原液。大肠杆菌的菌落一般是杆状，白色，圆形，透明或半透明，鉴定：大肠杆菌（Escherichiacoli,E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5X1〜3微米。周身鞭毛，能运动，无芽胞。革兰氏染色阴性菌呈红色。藤黄八叠球菌一般八个菌体聚在一起，似“叠罗汉”，亦称为藤黄八叠球
8、菌，也可单个、成双、四联排列或呈立体包裹状不规则。菌落直径一般为1・0〜1・5微米，呈金黄色。在所有培养基上均呈堆团排列。革兰氏染色阳性性菌呈紫色。【菌悬液】在无菌
