真核细胞的基因转染技术

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1、真核细胞的基因转染技术将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。其中，核酸包括DNA，反义寡核苷酸及RNAi（RNAinterference）。基因转染技术被广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。基因转染的定义如何将核酸转导至真核细胞？转染：通过生化或者物理方法将目的基　　　因导入真核细胞中。感染：通过病毒介导，用基因组中携带　　　有克隆目的片段的病毒来感染靶　　　细胞。病毒介导法通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞,之后反转录酶启动合成DNA并随机整合到宿主基因组中。以病毒为基础的

2、基因载体,是对其病毒基因组进行操作和改造，使它携带外源基因和相关基因元件，并被包装成病毒颗粒。携带外源基因的病毒载体被包装成病毒颗粒就构成了基因导入系统。物理方法基因枪粒子轰击法将DNA用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNA在胞内逐步释放,表达。显微注射法用显微操作将DNA直接注入靶细胞核。转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞。电穿孔法高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入。转染大的基因（>65kb）。生化方法DEAE－葡聚糖法正电DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞。可以转染的细胞系有限磷酸

3、钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞。阳离子聚合物法带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用,并通过内吞作用进入细胞。阳离子脂质体试剂带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物,然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合;另一种解释是通过细胞是内吞作用而被进入细胞。特点可用于稳定转染、瞬时转染几乎可以适用于所有细胞，使用方法简单,可携带大片段DNA,通用于各种类型的裸露DNA或RNA,能转染各种类型的细胞,没有免疫原性。实验目的实验利用能表达绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-n1,在阳离子脂质体介导下,转染

4、到肿瘤细胞系Hela细胞中，并用荧光显微镜观察GFP在细胞中的表达情况。掌握基因导入真核细胞的常用的方法.阳离子脂质体试剂瞬时和稳定表达瞬时表达分析检测未重组质粒DNA上基因的表达．DNA转染后，转入基因的表达可以在1－4天内检测到．几天内，大部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了稳定转染细胞系的筛选要进行稳定的表达分析，在转染后４８小时低密度传代铺板(一般按1：8-10传代)，给予生长空间，加入抗生素，在几天或数周内保持筛选压力，杀死未转染细胞，转染的细胞呈现克隆性生长。成功的基因转染取决于质粒DNA的质量必须无蛋白质，无RNA和其它化学物质的污染

5、，无毒素，OD260/280比值应在1.8以上经典的CsCl梯度离心，以及转染级的质粒DNA纯化试剂盒得到的ＤＮＡ都比较可靠．细胞铺板密度用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。一般转染时，贴壁细胞密度为70%-90%，悬浮细胞密度为2×106-4×106细胞/ml时效果较好，确保细胞在对数增长期．最好在细胞未长满时转代，并在第二天用于转染．培养基中的抗生素阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低．所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用

6、青霉素和链霉素DNA与脂质体的比例对于大多数阳离子脂质体试剂，应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。尽管大多数脂质体试剂说明书都推荐了比例，但每个实验得到的ＤＮＡ的质量,不同的细胞以及相同的细胞不同的生长状态可能得到的结果都会有差异．有血清时的转染因为血清会影响复合物的形成，所以在DNA-阳离子脂质体复合物形成时应不含血清，在转染过程中是可以使用血清的，但阳离子脂质体和DNA的最佳量在使用血清时需要进行优化．最好用不含血清的培养基转染，在转染２－５小时后，再换用含血清的培养基．谢　谢　！