脱氢酶活性的测定

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1、脱氢酶活性的测定一.实验目的了解活性污泥脱氢酶活性的测定原理及方法二.实验原理活性污泥法对于有机物的降解，实质上是微生物经过一系列的酶的催化作用下的生物氧化还原反应。参加生物氧化的重要酶为氧化酶和脱氢酶二大类，其中脱氢酶类尤为重要。其中脱氢酶能使氧化有机物的氢原子活化并传递给特定的受氢体实现石油烃的氧化和转化。如果脱氢酶活化的氢原子被人为受氢体接受，就可以通过直接测定人为受氢体浓度的变化间接测定脱氢酶的活性，表征生物降解过程中微生物的活性。因此，脱氢酶的活性可以反应处理体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，以评价降解性能。脱氢酶活性测定方法有MB.2H定性分析法和T

2、TC比色法，目前用得较多的为氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法。利用TTC作为人为受氢体，其还原反应方程式如下：无无色的TTC受氢后变成红色的TF（三苯基甲月替），根据红色的深浅，测出相应的光密度（OD值），从而计算TF的生成量，求出脱氢酶的活性。三.实验设备及药品1．紫外-可见光分光光度计、分析天平、50mL棕色容量瓶、50mL三角瓶、比色皿2．4mg/mL的TTC溶液：取400mgTTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑，分析纯）和2g葡萄糖(0.1mol/L)分析纯溶于少量蒸馏水中，再稀释到100mL的容量瓶中，贮存于棕色瓶中，一周更换一次。3.Tris-HCl2

3、0ml1mol/L缓冲液（pH=8.4）：称取6.037gTris（三羟甲基氨基甲烷，分析纯）的盐酸，再定容至1L。，再加入4.10%硫化钠：称取10gNa2S（分析纯），定容到100mL的容量瓶中。5.无氧水：0.36g亚硫酸钠定容到100ml容量瓶中。四.实验步骤1．标准曲线的绘制⑴不同浓度的TTC系列溶液的配置：从TTC溶液中移取1，2，3，4，5，6，7mL放入七个50mL的容量瓶中，定容到50mL。⑵取7支试管，分别加入2mLTris-HCl缓冲溶液、2mL无氧水、2mL不同浓度的TTC溶液,第八支为对照组。每支试管各加入1mL10%Na2S溶液混合，摇匀，

4、放置20min，使TTC全部还原成红色的TF。各管加入5mL氯仿，振荡摇匀以提取TF，稳定数分钟。取下层的氯仿溶液在分光光度计上，波长485nm比色。并作出标准曲线。2.土壤中微生物的脱氢酶活性测定⑴取待测土样2g于50mL三角瓶中，接种于20ml基础培养基中，放少许灭菌后的玻璃珠，放入摇床震荡2h。⑵将土壤混合液全部转入离心管离心，3000rpm，15min，取出离心管，将上清液倒入容量瓶中，再用纯水离心洗涤三遍，上清液均倒入50mL容量瓶中，洗涤后沉淀50mL用纯水稀释并转移至另一⑶从两个容量瓶中各分取50mL5mL容量瓶中，分别定容混合液，分别加入5mLTris

5、-HCl缓冲溶液5mL蒸馏水及10mLTTC溶液；同时从每个容量瓶中分别吸取5mL混合液，加入5mLTris-HCl缓冲溶液5mL蒸馏水及10mLTTC溶液，再加入0.5mL甲醛固定以作样品空白；将空白与待测样品分别在37°C下振荡培养30min，然后向管内加入2mL硫酸终止酶反应⑷向样品培养液及空白对照管内各加入5mL氯仿萃取TF10min，3000r/min离心5min后取氯仿溶液，于波长485nm的进行比色，记录吸光值，根据样品显色液与样品空白的吸光值的差，查标准曲线，进而得出脱氢酶的活性。⑸对比以上清液和离心沉淀分别测得的吸光度值，确定土壤脱氢酶活性测定的取

6、样点。并确定以后的标准方法五.实验结果分析和思考题脱氢酶活性可按下式进行计算：TF=25*(1+θm)*A*B单位：g/g干土其中：25为换算常数θm为土壤质量含水率A为标准曲线上的计数B为培养时间校正值，即反应时间除以60分钟