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1、高效液相色谱法测定大豆提取物中大豆异黄酮的含量【摘要】奉文建立了大豆提取物中大豆界黄酮酌高效液相色谱测定方法.通过正变试验确定了样品水解。最佳条件为：1.Otool/1HCl—MeOII溶解、80~C下、回流水解0.5h•釆用Nova—PakC1B3.9X150mm4ktni色谱枉，MeOH—0.4%P04(47：53V/V)为流动相，流速0.7ml/min,检测波长260nlll等色谱条件下洲定貳元含量。通过换算因子计算大豆异黄酮的含量。该方法快速、灵敏、重现性好，回收率达99%,变异系数小于3%。为产品的进一步开发研
2、究打下了盘好基础。【关键词】大豆提取物；大豆异黄酮；黑兰丝；正变设计法；方差分析；高效液和色谱法C、八0.刖S大豆由于富含多种生物活性物质，一直是人们关注的热点。随着现代研究的不断深入，大豆异黄酮防治心脑血管疾病，预防乳腺癌和骨质疏松症，改善更年期症状等作川逐步被人们所认知。目前,国内已有十多家企业对其进行研究、生产,但检测方法各异。采用测定黄酮化合物的比色分析法，样站中有其他色索的干扰;紫外分光光度法虽然方便、快速，但不能测世单一成分，只样品处理不当会冇杂质干扰。鉴于此，冇必要研究一种可靠的人豆异黄酮的含量检测分析方法
3、。人豆异黄酮是多酚类混合物，人豆异黄酮的组成、存在形式主要包括染料术素(gnistein)＞大豆黄素(daidzeln)和黄豆黄素(glyeitein),天然情况卜•它们主要以7-0一葡萄糖贰形式存在。本文对大豆捉取物屮异黄酮含量的高效液相色谱测定方法进行了系统的研究，并对样品的前处理条件进行探讨。为产品的进一步开展研究打下了良好的基础。1•试验材料与方法1.1仪器高效液相色谱仪,25此微量注射器,50型微孔滤膜，超声波清洗器1.2试剂与材料对照品大豆黄素、染料木素、黄豆黄素由本实验室分离制备。卬醇：色谱纯试剂。水：白制
4、，二次重蒸；具余试剂均为分析纯。标准溶液:准确称取对照品大豆黄素、染料木素、黄豆黄素各lOmg,加入lOOrid容量瓶中，以甲醇溶解，定容至刻度,作为标准储备液。人豆提取物：木实验室研究提取。1.3色谱条件色谱柱：Nova—PakCi83.9X150mm4Min(Waters公司)流动相：分析试元用流动相MeOH：0.4%H3PO4:55：45(v/v)；流速0・7m1/min分析贰元用流动相MeOH：0.4%P04=30:70(v/v)；流速0.7ml/min柱温：25°C检测波长:260nm1.4分析方法1・4・1标
5、准曲线绘制精密吸収一定体枳的标准储备液，配制成不同浓度的标准溶液，进样分析，测定各组分的峰而积，绘制标准曲线。1.4.2样品处理准确称取大豆提取物样品20mg,加1.0mol/L盐酸甲醇溶液加40m1,于80°C水浴屮I叫流水解0.5h，冷却并定容至100m1,摇匀后供液相色谱分析。测定水解后组分的峰血积,计算大豆界黄酮的含量(染料木素、大豆黄素、黄豆黄素与其相应试的换算因子分别为：1.60。1.64•1•54)。2•结果与讨论■I大豆・2・1色谱条件选择以人豆提取物屮主要成分的水解产物染料木素、人豆黄素和黄豆黄素和互间
6、基木分离为指标，确定色谱分离条件。从图1,2可见，实验中采用Nova—PakS3・9X150nm4pm色谱柱，以MeOH：0.4%HfO尸55：45(v/v)作为流动相分析狀元，流速采用0.7rot/rain,大豆黄素与黄豆黄素问分离度达1.18,染料木素为独立峰，以MeOH：0.4%H3PO4：37:70(v/v)作为流动相分析试，大豆黄索貳与黄豆黄索貳间分离度达1.32,染料木素试为独立峰，两种流动相的选择均比较合适。0・4%H3P04的加入可有效改善色谱峰的分离。2.2线性关系分析准确移収标准储备液0.5、1.0、
7、2.0、4.0、8.0m1并分别定容至10ml；准确吸取10乩溶液进样，以峰而积(y)与组分浓度(x)进行线性回归分析，得到回归方程依次为：人豆黄素y=582450x-198,r=0・9998；黄豆黄素y二805610x-298,r：0・9998；染料木素y=979340x-107,r：0.9996。线性范围分别为2・60—83・2AL/ml、2・088一66.8ML/ml、2・388—76・4吐/ml.2・3样品预处理条件探讨大豆提取物屮主耍成分以7-0一葡萄精貳形式存在，但由于试的对照品不易提纯获得，而试元对照物制备
8、及提纯相对容易，因而在测定过程中可以用试元作为对■照胡，样站可经水解后分析，再经换算为大豆异黄酮的含量。染料木素、大豆黄素、黄豆黄素与其相应貳的换算因子分别为：1.60,1.64,1.54。对影响样品水解条件的主要因素(酸浓度、水解时间、水解温度等)进行三因素3水平止交试验，确立样品分析时的最佳处理条件，以总杲黄酮含
