抗凝良药水蛭素的研究进展

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1、抗凝良药水蛭素的研究进展陈华友黄静蒋芝君邢自立吴自荣(华东师范大学生命科学学院上海200062)摘要从水蛙素的分子生物学性质、克隆表达研究，以及临床应用研究等主要方面论述抗凝防栓良药水蛭素的研究进展。并对水蛭的临床应用价值，开发研究成为抗栓领域的一大热点进行了论述。关键词水蛭素大肠杆菌表达系统枯草杆菌种作用力同时影响水蛭素的三维结构。2分子结合当今心血管疾病已成为危害人类健康的头号大敌,水妳索口古以来就是防栓抗凝逐瘀Z良药，首载于《神农本草经》、后在《本草纲目》和《中国动物药》等专著中均有收载，但夭然水蛭索来源有限，使其不能广泛应用

2、。自从1986年重纽水蛙索问世以來，开始了大规模的临床应用研究，可用于抗凝抗栓，治疗不稳定性心绞痛，急性心肌梗塞，血管成形术后血栓形成，血液透析，体外循环，弥散性血管内凝血等等，其效果明显优于肝索等，而乂无肝索诱导的血小板减小症和血栓复形成、肾衰等后遗症。水蛙素又无毒性，无明显抗原性，在合理剂量内，没有引起出血的危险，因此它将成为防治血栓类疾病的新一类药物，具有很大的社会效益和经济效益。木文主要从水蛭索的分子生物学性质、克隆研究进展以及临床应用研究等方面进行综述。I水蛭素分子生物学性质研究1954年，Markward从水蛭头部唾液腺

3、中分离出水蛭素纯品，开始对其组成结构和理化性质进行研究。20世纪60年代进一步发展了天然水蛙索的分离和纯化技术，得出水蛭素由65个氨基酸残基组成，分子量为7000D。20世纪70年代确证了肽链的组成和一级结构。20世纪80年代完成了二级和三级结构分析。N端有3个二硫桥，使N端肽链绕迭成密集形核心环肽结构。C端富含酸性氨基酸残基,具亲水性，游离在分子表而。肽链中部还有一个rhprO-]ys-17-pro组成的特殊序列，不被一般蛋白IW所降解。水蛭索是现在知道的最强的凝血酶特异性抑制剂，带负电的C端结合在凝血酶的带正电的纤维蛋白原识别位

4、点，最小保持抗凝活性的片段为酸性C端的10〜12个肽段，C端12具有最大活性的最小肽段。N端密集链段则同凝血酶催化位点结合，抑制凝血酶的催化作用。Tyr-能的硫酸化可提高抗凝活性，The殂G1U57,1匕59是抗凝中必不可少的，水蛙索47位赖氨酸残基同靠近凝血酶催化位点附近的精氨酸侧链(ArgSideChainPocket)带负电荷的碱基，起着促进N端与活性位点结合等巫耍作用，lys47也通过氢键和静电两2003年第38卷第3期生物学通报例为1:1,解离常数为K=2.3X10-Limo1/L,故芨合物非常稳定，使凝血酶不能分解纤维蛋

5、白原，及不能诱导血小板反应，也使凝血酚的刺激成纤维细胞增生利平滑肌细胞收缩等作用受抑制，从而达到抗凝的效果。水蛙素异常稳定，单纯温度升高到100C或pH值改变，不影响其活性，只有碱性条件下加热才能失活。在pH13条件下经80°C处理15min活性完全损失。在体内，水蛭素不被降解，皮下注射重组水蚯素后半衰期为1〜2h、8h后降到最低水平，需1次/8h才能达到冇效浓度。静脉注射消除小半衰期为1h,70%〜85%以活性组分经肾排出。水蛭素还可抗胰蛋白酶水解，经胃蛋白嗨和糜蛋白酶消化后，N端核心区未被破坏，依然有很高的抗凝活性，使水蛙素可成

6、为一种口服药。2重组水蛭素克隆概况近年来，已冇不少实验室能在大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞等表达系统中表达水蛙索，水蛙索克隆研究发展迅速，各表达系统自有优缺点。2.1重纽水临素在大肠杆菌中表达1986年Harvey等［叮从水蛭组织中分离出对水蛭素进行编码和复制的cDNA,并在大肠杆菌细胞中表达成功，获得r-IIV2,使水蛭素的制备获得了突破性进展，成为基因工程和抗栓领域的一大热点。同年，Dodt等⑵人依照水蛙素的氨基酸排列次序，化学合成了229bp的I)NA片段，将其插入载体质粒中，在半乳糖苻酶启动子或噬菌体KpL启动子的控制下，在

7、大肠杆菌屮表达。1996年罗春贞等⑶按照天然水蛙索分子的氨基酸顺序，设计并合成了水蛙索基因，并融合了RGD三肽编码顺序，构建pSGHRE表达质粒，并转化到大肠杆菌JF1125中表达，上清活性为20ATU/mL。1997年毕群等［4］通过递归PCR合成水蚯素基因，并重组到犬肠杆菌分泌型表达载体pIN-ompATil中，位于大肠杆菌外膜蛋白A信号肽下游,转化大肠杆菌DH5A,成功地表达,表达量占菌体蛋白19.8%,并且有明显抗凝血酶活性，经分离纯化，产物质谱分析成分单一，分子量为6893.1D。1998年刘风云等［5］成功地构建水蛭素1

8、2肽与低分子呈尿激酶融合基因，在大肠杆菌屮获得农达，東纽融合蛋白具有溶栓与抗凝双功能。总的來说，表达量不高，低于总蛋白的()•1%,且包涵体不利于下游纯化，人们不断研究在其他表达系统中的表达。2.2重组水蛭素在酵母菌中的表达Loiso