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《基因重组酵母菌株的发酵特性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、基因重组酵母菌株的发酵特性研究柳聪聪（1英博双鹿啤酒集团有限公司技术中心，浙江温州325014）摘耍：釆用现代生物技术，获得具有B■葡聚糖酶基因序列兼具蛋白酶A缺陷型的基因重组酵母菌种。本研究通过实验室扩培和200L小试设备的生产试验，鉴定了该菌种具有B■葡聚糖酶和蛋白酶A的酶活特性，且遗传稳定。研究还表明，使用该菌种，啤酒的易滤性和泡持性都得到了提高,且发酵的各项主要性能止常。关键词：易滤性，B■葡聚糖，泡持性，蛋白酶A,基因重组酵母，一些学者的研究发现，a•葡聚糖和B•葡聚糖、戊聚糖、粘胶蛋白等大分子胶体物质与啤酒的粘度有关，从
2、而影响啤酒的过滤。根据相关科技报道，影响啤酒易滤性的主要物质是酒液中的B■葡聚糖，尤其是凝胶态的B■葡聚糖⑴。啤酒泡沫是判断啤酒质量的一项重要指标，而酵母蛋白酶A是影响泡沫稳定性的一个主要因素。特别是纯生啤酒的泡沫问题会受到蛋白酶A（PrA）很大程度的影响⑵。我公司与浙大食品科学与发酵工程研究所合作，采用现代分子生物学技术，将酵母中的蛋白酶A基因敲除，并使用外源的（3■葡聚糖酶基因通过质粒转导进行替换。使啤酒酵母获得B■葡聚糖酶这一遗传信息，达到在啤酒发酵过程中产牛B■葡聚糖酶，直接将发酵液中的B■葡聚糖分解，从根本上消除B■葡聚糖
3、及其凝胶对啤酒过滤影响，同时，有效抑制蛋白酶A对泡沫稳定性的消极影响的目的。本项研究采用该基因重组酵母菌株，进行实验室及200L规模的啤酒发酵试验，以观察英在生产条件下的发酵特性。一、实验室发酵试验建立0■葡聚糖和蛋白酶A的分析方法，验证具有B■葡聚糖酶基因序列兼具蛋白酶A缺陷型酵母菌种作为啤酒牛产酵母的遗传稳定性，鉴定其生产、发酵的各项主要性能。1、B■葡聚糖酶酶活鉴定1-1＞检测方法B•葡聚糖酶活性测定采用3,5•二硝基水杨酸（DNS）法（Miller,1959）：YEPD培养液lOOOOrpm离心2min,上清作为粗酶液，取O
4、.lmL加入50°C水浴中预热lOmin的0・9mL底物溶液（0.5mg/mL地衣多糖，pH6.0磷酸缓冲液配制）中，50°C准确反应10min,加入1.5mLDNS沸水浴5min,用冷水快速冷却，测定OD520nm。酶单位定义为：在50°C,pH6.0条件下每min从底物中释放lnmol还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶活单位（U）。1-2＞检测结果对两株重组酵母菌株1,2经过活化，对培养上清液中的酶活进行测定。结果显示从转接32h开始有酶活出现，然后迅速上升，酶活的最大值出现在56-64hZ间，两株菌株分别为28.1U和20
5、.2U随后略有下降，两株重组酵母有相同的表达B•葡聚糖酶的变化曲线。培养时间对B■葡聚糖酶影响的变化见图lo图1重组菌株1,2的产酶曲线Fig4-5B・l,3・1,4-glucanaseactivityoftherecombinantstrain1,22、蛋白酶A酶活鉴定：2-l＞检测方法：2mLl%酪蛋白溶液与0.2mL酶液于37°C保温20min,加10%三氯醋酸2ml终止反应lOmin后，15000g离心15min,上清液用Lowry法(660nm)或改进的Bradford法(0.1-0.5ml上清液与3ml蛋白试剂反应)(5
6、95nm)测定光密度值。空白反应液中的酶先用10%三氯醋酸灭活15mino一个酵母蛋白酶A活性单位定义为25°C,pH6.0条件下每分钟水解lmg氧化的胰岛素B链所需的酶量。2-2＞检测结果：对发酵后期酵母处于衰亡期大量裂解后的液中蛋白酶A的活性进行测定,结果显示重组酵母菌1,2中的蛋白酶A的活性比岀发菌株WZ65中低。表1重组菌与对照酵母菌蛋白酶A活性测定Table6-2PrAactivityofrecombinantS.cerevisiaeandthecontrolPrAActivity(U)WZ651st48.932.536.
7、74th46.43033.27th49.728.335.510th50.129.630.1重组酵母1重组酵母23、发酵性能对酵母进行扩培，25°C培养后，在转接到新的斜面上，并在4°C条件下低温保存，共转接20代。并选取其中的1代、5代、10代、15代酵母，进行扩培（3000ml）、发酵，分别对其生产繁殖力，发酵力，凝聚力，双乙酰还原能力，死亡率，B■葡聚糖降解能力等遗传性能进行检测鉴定，与大生产菌种对比。性能鉴定。从上述试验结果，可以基本确定该酵母的遗传稳定性。3・2、与大牛产使用菌种的性能对比聚糖的降解能力，蛋白酶A活性也有明显
8、下降。另外，该酵母生长性能与A酵母比较接近，小试生产阶段将使用两株基因重组酵母与A酵母进行同步试验，进一步验证、比较相关性能。二、200L小试设备发酵试验使用相同的牛产工艺和牛产原料，设定相同的生产条件，将两株基因重组酵母菌株和生产用
