【精品】植物组织培养实验指导

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1、植物组织培养实验指导实验项目、内容提要及实验安排一览表序号实验需称内容提要实验要求集中实验时数实验类型每组人数1实验用具的洗涤和灭菌培常用用具（如玻璃器皿、剪刀、银了等）的洗涤技术和灭菌方法及注意事项必开6验证22培养基（MS）母液的配制配制培养基（MS）的各种母液必开6综合23培养基（MS）的配制及灭菌培养基的配制必开4综合2接种用具及培养基的灭菌44植物外植体消毒和接种材料的灭菌必开4综合2接种65愈伤组织的诱导初代培养必开6综合2观察、统计及拍照记录46愈伤组织的继代及分化培养基的配制、灭菌，接种及继代培养必开6综合2观察、统计及拍照记录47愈伤组织的生根培养（植株

2、再生）培养基的配制、灭菌，接种及生根培养必开6综合2观察、统计及拍照记录4实验一实验用具的洗涤和灭菌【目的】使学生了解植物组织培养中常用的洗涤技术和灭菌方法；掌握培常用用具(如玻璃器皿、剪刀、银子等)的洗涤技术和灭菌方法及注意事项，为后续实验做准备。【实验用具】高压蒸气灭菌锅、实验所需的各种玻璃器皿、金属用品及犁料用品。【实验方法】1.洗涤技术1.1洗涤液珞酸洗涤液是川重珞酸钾(K2CHO7)与硫酸(H2SO4)配制而成，可根据需要配制成弱、屮、强三种。弱：用重侪酸钾40g加入蒸饰水1L,加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸90mlo屮：川重珞酸钾4()g加入蒸饰水l(X)m

3、l,加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸875mlo强：与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重钻酸钾，直到重铭酸钾达到饱和为止。一般浓硫酸1L加入重珞酸钾40g。1.2洗涤方法(1)玻璃器肌洗涤新的玻璃器皿上附有游离的碱性物质，其洗涤方法是用1%的HC1溶液浸泡一昼夜，再用合成洗涤剂洗刷，然后用清水反复冲洗，最后用熬懾水冲洗1〜2次，T•燥后即可使用。已使用过的试管、烧杯、三角瓶等的洗涤方法是，先将器血中的残渣除去，用清水洗净，再用合成洗涤剂洗刷，川清水冲洗干净，最后川蒸懈水冲洗1〜2次。川过的吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品，需先放入珞酸洗涤液中浸泡两小时以上，取出后经流水冲洗半

4、小时左右，再用蒸懈水冲洗1〜2次，然后烘干或晾干。载玻片和盖玻片容易破碎，洗涤时不宜用力擦洗，其洗涤方法是先用清水冲洗，然后放入路酸洗涤液屮浸泡儿小时或用稀珞酸洗涤液煮沸半小时，取出后川清水冲洗干净，将其储藏在95%的酒粘中。⑵塑料用品洗涤塑料用品一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较强，因此冲洗时必须反复多次，最后用蒸懈水冲洗。(3)金属用品洗涤金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，-•般川酒精擦洗，并保持干燥。2.灭菌、消毒技术物理方法：物理灭菌干热、湿热、射线处理；物理除菌过滤、离心沉淀等。化学方法：消毒剂、抗菌索灭菌2.1培养基灭菌分装好的培养基置于高压熬汽灭

5、菌锅中灭菌，灭菌条件为温度12TC,压力l.lkg/cm2,灭菌时间与培养基容量的关系见下表。如果使用人丄控制的灭菌锅，必须注意灭菌温度的稳定控制，因为温度过高会引起培养基成分和pH的改变，而温度过低则会造成灭菌不彻底。灭菌后的培养基室温下最好在1〜2周内用完，特殊情况可贮存于4°C卜1个月左右。培养基体积与灭菌时间的关系培养基体积（mL）灭菌温度（°C）灭菌时间（min.）20-501212050-50012125500-5000125352.2玻璃器皿灭菌玻璃器1111可任选湿热和干热灭菌方法灭菌。湿热灭菌条件与培养基灭菌条件一致，但耍适当延长灭菌时间，一般以25〜3

6、0分钟为宜。湿热灭菌后器血和包装表面常常有水蒸气覆盖，如果不及时干燥常常容易微生物的再侵染，因此，器血灭菌后应及时放入净化工作台上吹干。干热灭菌即在烘箱中加热至160〜180°C后恒温保持40分钟,或120°C灭菌2小时。玻璃器」III•放入烘箱之前必须完全干燥，以免引起破碎，火菌时温度要缓慢上升，火菌后待温度逐渐下降到60°C以下时才能开箱门，以免器肌因突然冷缩而破碎。2.3金属用具灭菌银子、剪刀、解剖刀、接种针等金属制品，使用前和使用过程中均必须灭菌并保持无茵状态。使用前的灭菌可采用干热灭菌。使用过程中的灭菌通常是将其浸泡在70%的酒精中，再以火焰将酒精烧去，待冷却后

7、使用。也可使用-•种小型电热石英砂灭菌器，代替酒精灯,每次使用完质，将用具插入消毒器的中消毒，用时取出冷却。2.4接种室灭菌接种室污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孑包子。因此，每次接种前应进行地面的淸洁卫生工作，并用70%酒精喷雾使空气中的灰尘沉降，并用紫外线灯照射20min,接种前工作台而要用新洁尔灭或酒精擦洗，使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效。但它应駅放在洁净的房间，窗户密封，并定期清洗过滤膜，以延长使川寿命。2.5外植体灭菌：（1）选取生长正常、无病虫危害的组织材料，除去多余部分后将材料整理成适当的人小放入烧