真核生物组织DNA的提取

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1、真核生物组织DNA的提取TotalDNAextractionfromeukaryotictissue实验目的了解真核生物基因组DNA提取的一般原理通过植物组织DNA的提取，掌握真核生物组织中DNA提取的方法和步骤高等动物、植物的基因组相当宠大，如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成，果蝇基因组有１．４×１０８个碱基对。某特定物种的基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的，而研究的起点就是要获得纯度高－－不含蛋白质、

2、糖类、酚、氯仿等污染；基因组相对完整－－断裂的基因组以便用于以后ＰＣＲ分析，RFLP分析，基因文库的构建，基因探测等的研究。真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最后纯化出ＤＮＡ。DNA提取原则保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染实验原理植物细胞内各种DNA（包括基因组DNA和核外DNA）称为总DNA。高等植物的DNA与蛋白质结合成脱氧

3、核糖蛋白（DNP），能溶解在纯水或1mol/L的NaCl溶液中，而不溶于有机溶剂。目前从样品中分离DNA的方法主要有两种，分为CTAB法和SDS法（型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来）。十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltriethylammoniumbromiade,CTAB)是一种阳离子去污剂，可以有效的裂解植物细胞壁，且与DNA形成可溶于高盐溶液的复合物，当降低盐浓度时DNA又可沉淀析出，从而与蛋白质及多糖等分离。SDS（十二烷基硫酸钠）是阴离子表面活性剂，

4、溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即得植物总DNA溶液。之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到较纯的DNA制剂。SDS法提取植物组织DNADNA含量和纯度的检测DNA的吸收光谱峰在260nm处，据计算，测定此波长下DNA溶液

5、的OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50µg/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质的吸收峰在280nm处，在测定DNA含量时，还常计算OD260/OD280之值，如该值为1.8-2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。试剂提取缓冲液：100mmol/LTris·Cl(pH8.0),20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS24：1的氯仿：异戊醇预冷无水乙醇SDS抽提液配方(1000ml):操作步骤叶片

6、0.5g左右,剪碎,置研钵中，加入1mL提取缓冲液，研磨成浆；吸入10mLEP管中，剧烈摇动混匀；60℃水浴保温30-60min，不时颠倒混匀；室温下3000rpm离心10min；小心吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇，剧烈震动；室温下3000rpm离心10min；小心将中间层吸入新的离心管中；加入1倍体积预冷95%乙醇，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。8000rpm离心5min，弃掉上清；75％酒精洗一次，晾干沉淀；加入5μLRNaseA（10μg/μL）,37℃10min,除去RNA。

7、加50-100μl水融解，-20贮存。结果分析与讨论