现代生化药学复习提要 2009年12月使用

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1、.现代生化药学复习提要 2009年12月使用 第一章PCR1PCR的英文全称是什么?PolymeraseChainReaction2PCR是谁发明的？KaryMullis3PCR的基本原理是什么？PCR的基本工作原理，是以拟扩增的DNA片段为模板，以一对分别与模板DNA互补的寡核苷酸为引物，在DNA聚合酶的作用下，根据半保留复制的机制沿着模板DNA链延伸，直至新的DNA合成。不断重复这一过程，则可使目的DNA片段得到扩增。4PCR反应的产物中一般会生成几种长度不同的产物？反应结束时他们的含量分别是怎样的？PCR反应中一般会产生2种不同长度的产物：一

2、种是预期长度的产物，一种是比预期长度长得多的产物；前者以指数级数增加（2n），后者以几何级数增加（2n）。因此后者在总产物中所占比重很小，可忽略不计。5一般PCR反应中包括几种基本成份？它们的功能分别是什么？模板：待扩增的DNA或RNA；引物：与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。只有每条引物都与靶DNA特异性结合，才能保证其特异性，引物越长，特异性越高。两段引物间的距离决定了扩增片断的长度；两引物的5’端决定了扩增产物的5’端位置。说明引物决定了扩增片断的长度、位置和结果。6PCR反应对模板有什么要求（种类

3、及质量要求等）？基因组DNA、噬菌体DNA、质粒DNA、cDNA、mRNA、预先扩增的DNA均可作为模板。PCR反应对模板质量要求不是很高，经过标准分子生物学方法制备的DNA可以作为模板，但是模板中绝对不能含有蛋白酶、核酸酶、Taq酶抑制剂和任何可以结合DNA的蛋白质；虽然片段长短不是影响PCR效率的关键因素，短片段模板PCR效率更高；为保证反应的特异性，应使用ng级的克隆DNA、μg级的单拷贝染色体DNA、或104拷贝的待扩增片段。7什么叫PCR的引物？什么叫特异性引物？什么叫简并性引物？引物是与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，

4、是决定PCR特异性的关键。只有每条引物都与靶DNA特异性结合，才能保证其特异性，引物越长，特异性越高。8引物设计的基本原则有哪些？a.引物长度一般在20～24bp：这样长度的引物保证了不易形成杂合体；b.（G+C）%：两段引物的此数值应相近；在已知模板序列的时候应与模板的相近。a.引物本身不能形成明显的次级结构，如发卡结构；b.两引物不可配对；c.引物3’端为DNA聚合酶连上寡核苷酸的地方，因此应严格、准确地配对。9PCR中使用的DNA聚合酶有哪几种，各具有哪些特点？a.Klenow片段：为DNA聚合酶Ⅰ的片段，具有聚合酶活性和3’~5’外切酶活性

5、；b.Taq酶：耐热DNA聚合酶，可耐受93～95摄氏度，是PCR普及的关键。它避免了不断补加DNA聚合酶的繁琐操作，提高了退火和延伸的温度，减少了非特异性产物和DNA二级结构的影响，提高了PCR的特异性、敏感度和产量。它没有3’~5’外切酶活性，无校对功能。c.Stoffel片段：第二代耐热DNA聚合酶，将97.5摄氏度的半衰期提高到20min，而Taq酶只有5min；对复合PCR（2个或以上模板位点的PCR）更有效；d.Vent酶：耐受100摄氏度以上高温达2h；具有校对功能。e.RTth逆转录酶：有依赖于RNA的耐热DNA聚合酶活性和依赖于D

6、NA的耐热DNA聚合酶活性，这两种活性分别依赖于Mn2+和Mg2+。10PCR反应中对于加入的dNTP有什么要求？dNTP应具有一定浓度：浓度过高会抑制Taq酶活性，较低浓度可降低错误掺入，浓度过高会导致错误掺入，浓度过低会导致产量过低；4种dNTP应有一样的浓度，否则会诱导聚合酶错误掺入而降低产率、提前终止反应；不能反复冻融，否则会降解。11PCR反应中加入的二价阳离子有什么功能？常用的是什么离子？缓冲液中二价阳离子的存在至关重要，因为耐热DNA聚合酶需要游离的二价阳离子作为辅助离子，它影响着PCR的产量和特异性。常用Mn2+和Mg2+。12PC

7、R反应一般分为几个步骤？各步骤有什么特点？A变性：双链DNA变成单链DNA。变性温度的高低由G、C含量决定；变性时间由DNA链长度决定。常规PCR变性条件为94～95度45s。B退火：指单链DNA与引物特异性结合。退火温度太高则效率低，退火温度太低则出现非特异性复性。C延伸：寡核苷酸的延长，一般在耐热DNA聚合酶的最适温度下进行。对于Taq酶，为72～78度。13什么叫PCR的反应平台？形成的原因可能是什么？PCR反应不是无穷的进行，到了PCR后期，当产物达0.3～1pmol/L时，产物不是呈指数增长而是进入平台期，曲线由指数曲线变为平坦。形成原因

8、：由于引物和dNTP的减少，Taq酶失活；或由于底物过剩、非特异性产物的竞争、变性时解链不完全、退货时产物单链自行缔合、最