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1、转基因小鼠的鉴定一，剪鼠尾1,剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。2,分辨小鼠的年龄a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生；b当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3天；c当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4天；d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10天左右；e当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12天左右；f当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14天左右。3,剪鼠尾后对小鼠的标记一般在小鼠的耳朵或指甲上做标记，如果在用剪指甲来标记的话，时间过长则不易分辨。所以一般还是选
2、择用左右耳朵上剪的刀数来标记，正常情况下一笼小鼠不会超过10只，依次标记为左1刀，右1刀，左2刀，右2刀，左1右1刀，左2右1刀，左1右2刀，左2右2刀，左3刀，最后一只不剪耳。二，从鼠尾中提取DNA1,剪0.5cm的鼠尾，放入1.5ml的EP管中。2,加入500μlSNET,其中蛋白酶K浓度是400μl/ml。注：SNET鼠尾裂解液配方（100ml）：200mM的Tris-Cl取1M的Tris-Cl（PH8.0）2ml5mM的EDTA取0.5M的EDTA（PH8.0）1ml400mM的NaCl取2.34g1%（m/v）SDS取10ml10%SDS加水定容至100ml临用时加蛋
3、白酶K400μg/ml，即100ml的SNET加40mg。3,放入550C孵育过夜（最好放入摇床550C振荡过夜，也可放入550C烘箱过夜，第2天摇床550C振荡2~3个小时）。4，消化好后，每只EP管内加入14μl6MNaCl溶液，涡轮振荡仪上剧烈振荡30s-1min。5,12000rpm离心10min，取上清400μl到另一1.5mlEP管内。注：a离心时EP管对称放置且最好开口处靠近轴部；b取“另一1.5mlEP管”时，选择盖子内部正常无多余部分，以免第6步的絮状沉淀挂在多余部分。6,向每只EP管内加入2倍体积的无水乙醇800μl，轻轻翻转几次混匀，可见絮状DNA沉淀（若
4、看不见沉淀可在-200C冰箱中过夜促进沉淀）。7,12000rpm离心10min，弃上清，注意不要把沉淀倒出，再滤纸上抽尽残余液体。8,加入1ml70％的乙醇，将沉淀摇起。9,12000rpm离心10min，弃上清，再滤纸上抽尽残余液体。10,待乙醇完全挥发后，向每管中加入含RNase的TE50μl，在涡轮振荡仪上振荡片刻（以免EP管壁上的沉淀未被含RNase的TE浸没），370C左右的烘箱中溶解1~2小时。注：含RNase的TE是RNase与TE的比例为1:1000溶DNA的TE的配方（PH8.0）：100mmol/L的Tris-Cl（PH8.0）10mmol/L的EDTA（
5、PH8.0）分装后在15psi（1.05kg/cm2）的高压下蒸汽灭菌20min，RT保存.11,溶解好后，放入微波炉中低火微波20s，再放入超声仪中超声20s，接着水浴940C水浴20min以除去多余的蛋白酶K，最后放入-200C冰箱保存。一，PCR目前实验室的转基因小鼠AD,CNGA2,THY1,GFP,OMP-Cre体系可以用同一个体系。PCR反应的体系（20μl）：10×Buffer缓冲液（含2价镁离子）2μldNTP1μl25pmol/μl上下游引物0.5/0.5μlEasyTaq酶0.1μlDMSO1μl水14.4μlDNA0.5μl注：刚买回的上下游引物是干粉，需
6、加入适量TE（加入TE的量与管外侧的标记有关）溶解，这样可以贮存较长时间，要用时需用水稀释引物，引物与水的比例为1:3，这样上下游引物的浓度就是25pmol/μl先在1.5ml的EP管中加入总的体系再平均分装入各个PCR管中（一般多加两小管的量），将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP管中缓慢抽吸若干次（尽量避免产生气泡）以便Taq酶混合均匀，最后再在各PCR管中依次加入DNA样品。品系：AD两对引物APP（P1/P2）和PS1（P3/P4），APP为300bp左右，PS1为600bp左右，APP与PS1连锁，因此应该对应一致，程序为Main-LTLUO.CNGA2两对引物
7、R+（F引物/R+）和R-（F引物/R-），R+与R-位于X染色体上，R+为300bp，R-为250bp，只有R+则说明是野生型，只有R-则说明为阳性，既有R+也有R-则说明为杂合子，若R+与R-都没有则说明DNA没提好或PCR失败,程序为Main-CNG.THY1一对引物thy1/chr2，700bp左右，程序为103-CHR2.GFP两对引物wild（M71A/M71B）和EgFP（M71B/EGFP）,wild为350bp，EgFP为250bp，只有wild则说明为野生型，只有EgFP
