fat1转基因小鼠的构建与鉴定

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1、fat1转基因小鼠的构建与鉴定【摘要】目的构建和鉴定携带有外源fat?1基因的转基因小鼠。方法将fat?1基因的cDNA与动物表达载体pEF?neo连接，构建pEF?fat?1重组质粒,酶切、测序鉴定正确后，以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中，并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠，通过PCR、Southernblot杂交等方法确立阳性整合有目的基因的G0代小鼠。结果成功构建了pEF?fat?1重组质粒，将其显微注射到小鼠受精卵中，得到G0代小鼠，PCR、Southernblot杂

2、交确立了4只整合有fat?1基因的首建鼠。结论fat?1基因可整合到小鼠体内，得到的转基因小鼠为研究fat?1基因的生物学功能提供了动物模型。【关键词】小鼠转基因DNA重组fat?1基因［ABSTRACT］ObjectiveToconstructandidentifythetransgenicmicealexpressionvectorpEF?neoidpEF?fat?1eandsequencedcorrectly.TheobtainedlinearrebinantplasmidpEF?fat?1icroin

3、jectedintothearsenoblastsofmousezygote,plantedintotheuterustoproducetransgenicmice.PCRandSouthernblotedtoidentifythepositiveG0generationoffat?1transgenicmice.ResultsRebinantplasmidpEF?fat?1iceousetoobtainthetransgenicmousethatprovidesananimalmodelforthestud

4、yoffat?1gene.［KEYice,transgenic;DNA,rebinant;fat?1genefat?1基因于小秀丽线虫，SPYCHALLA等［1］利用在阿拉伯芥（Arabidopsis）中进行异种表达的方法确认了fat?1cDNA的序列。此cDNA的翻译产物是由402个氨基酸组成的n?3多聚不饱和脂肪酸（PUFAs）脱氢酶，相对分子质量为4.64万，是氧离子依赖的含铁酶，属于跨膜蛋白超家族。此酶的功能是以16～20碳的n?6PUFAs为底物进行脱氢反应，生成相应的n?3PUFAs。体外实验表明

5、，fat?1cDNA的表达可促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，保护神经细胞，并可改变细胞膜n?6/n?3PUFAs的比例，降低于n?6PUFAs的类花生酸的组成［2～7］。本文旨在构建和鉴定fat?1转基因小鼠，从而为fat?1基因在动物整体水平上的研究提供实验模型。1材料和方法1.1材料菌株XL1?Blue及pEF?neo质粒由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供。pcDNA?fat?1质粒(内含fat?1cDNA)由本室保存。各种限制性内切酶、DNA分子质量标准λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ及T4DN

6、A连接酶等均购自Promega公司；PCR引物由上海生工公司合成，DNA测序由北京三博远志生物公司完成。琼脂糖购自华美生物工程公司。DNA凝胶回收试剂盒购自Omega公司。其他试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1重组质粒pEF?fat?1的构建pcDNA?fat?1及表达载体pEF?neo用EcoRⅠ/XbaⅠ进行双酶切，8g/L琼脂糖凝胶电泳，分别回收、纯化1.3kb片段和大片段。将1.3kb的目的片段和载体片段以摩尔比3∶1连接，转化感受态大肠杆菌XL1?Blue后，用小量碱裂解法提取重组质粒。1.2

7、.2重组质粒pEF?fat?1的鉴定据相应酶切图谱，上述提取的重组质粒分别用EcoRⅠ/XbaⅠ、BglⅡ、XhoⅠ进行酶切鉴定，将阳性重组子命名为pEF?fat?1。1.2.3重组质粒pEF?fat?1的序列测定将酶切鉴定为阳性重组子的pEF?fat?1送交北京三博远志生物公司进行全自动序列测定。1.2.4转基因小鼠的获得pEF?fat?1经SpeⅠ/BamHⅠ双酶切后，8g/L琼脂糖凝胶电泳分离回收5.5kb的大片段，纯化，最后溶解于微注射缓冲液（内含10mmol/LTrisHCl，pH8.0，0.1mm

8、ol/LEDTA）中，并准确调整DNA至3mg/L，以3pL的量注射到小鼠受精卵的雄原核中，并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中。小鼠为清洁级昆明白小鼠。1.2.5转基因小鼠的整合检测提取4～6周龄G0代转基因小鼠尾尖DNA，用PCR法测定G0代转基因动物的整合情况。所用引物为:上游5′?GTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCG?3′；下游5′?GACGGAAAGCATCCACAGTTGG?3′。扩