医学第七组ppt课件.ppt

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1、生技大实验综合展示第七组组员1.单元一:目的基因的提取2.单元二:目的基因的连接转化及重组子筛选3.单元三:重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达4.单元四:重组蛋白的分离纯化及检测实验内容：www.wondershare.com实验原理1.总RNA的提取：RNA的提取一般是用强变性剂使蛋白质和DNA变性，利用有机溶剂抽提去掉蛋白质、多糖等；最后在RNA沉淀剂的作用下，分离出RNA。2.琼脂糖凝胶电泳：核酸分子带负电，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，主要具有分子筛效应。3.逆转录PCR：RNAD

2、NADNA逆转录酶PCR扩增单元一：目的基因的提取www.wondershare.com实验结果（1）紫外分光光度法测定RNA浓度：1.A260/A280=1.8~2.0最佳2.C(ug/ml)=A260×40×稀释倍数3个样本的RNA纯度较高，实验过程未出现污染均在2000ng/μL以上且分布较为均匀，说明RNA的提取较为充分，且研磨后样本的分装较为平均www.wondershare.com电泳检测RNA完整性1.三条明显的亮带2.28S和18SrRNA处为明显的亮带，5SrRNA带的亮度则较弱3.28S/18

3、S约为2:11号样品的条带相对2号和三号亮度较弱，原因可能是分装斑马鱼粉末时1号管的量最少，导致其RNA的总量也较少www.wondershare.comRT-PCR琼脂糖凝胶电泳一条明显的亮带组成，与Marker对比后可得产物的大小约为500bp，与目标相符1号样品中出现了两条带，分析原因可能是在1.样品中含有其他DNA2.PCR产物形成了不同的构象。3号样品出现了轻微拖带的现象，原因可能是：1.电泳缓冲液失效2.反应试剂或耗材中存在核酸酶导致核酸部分降解3.拍照前放置时间过长。www.wondershare.

4、com单元二：目的基因的连接、转化及重组子筛选实验内容：1.cDNA的TA克隆2.重组质粒转化大肠杆菌3.质粒酶切鉴定插入片段www.wondershare.com实验原理：1.TA克隆2.感受态细胞制备、质粒转化www.wondershare.com3.蓝白斑筛选www.wondershare.com胶回收DNA感受态细胞制备测OD筛选2号DNA１２正３负感受态细胞vector、solutionⅠTA克隆１’２’３’vector转化蓝白斑筛选实验步骤：随机挑选1、2、3、4号白色阳性菌落，进行菌落PCR鉴定随机

5、挑选上述过夜培养的1、2号菌落，进行双酶切鉴定www.wondershare.com双酶切鉴定菌液SolutionⅠ（EDTA、RNaseA）SolutionⅡ（NaOH）SolutionⅢ（中和）1.提取质粒2.双酶切10×Buffer，KpnI、XbalI、灭菌水灭火（65℃水浴中10min）3.电泳琼脂糖凝胶电泳结果www.wondershare.com实验结果1.蓝白斑筛选（LB/Amp/IPTG/X-Gal平板）www.wondershare.com空载质粒的摩尔数=3×10-15mol插入DNA片段的

6、摩尔数=1.933×10-12mol空载质粒的摩尔数：插入DNA片段的摩尔数≈1:1000，该比值远小于1:2到1:10的范围，待插入DNA片段过多，当时未稀释待插入DNA，直接进行了转化实验，导致实验组和对照组菌落密度偏大。www.wondershare.com空载质粒转化效率计算如下：1µl5ng/µl即5ng的质粒加入2号100µl感受态细胞EP管中，取50µl加LB/Amp/IPTG/X-Gal平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀涂布平板，第二天记录蓝色菌落共计6000，此时转化效率=6000cfu/（×5ng

7、）=2.4×103cfu/ng=2.4×106cfu/µg质粒www.wondershare.comwww.wondershare.com2.菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳Marker1234bp20001000750500250100www.wondershare.com3.KpnI/XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳示意图Marker12bp20001000750500250100www.wondershare.com单元三重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达www.wondershare.com实验原理——乳糖操纵子

8、的调控机制www.wondershare.com实验流程1234菌体活化、放大诱导收菌紫外灯观察、超破www.wondershare.com紫外灯下（UV365nm）1#-5#管观察结果实验结果www.wondershare.comwww.wondershare.com实验结果分析1#为阴性对照组，所用工程菌并不含有GFP序列，故不能表达荧光蛋白，紫外灯下无荧光。2#未加