RNA提取结果分析.ppt

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1、RNA提取结果分析2006.04.28100mg小鼠肝脏组织，液氮中研磨，组织碎末立即倒入3ml裂解液内。加入苯酚后离心，分三管收集上层水相，TE稀释40倍测OD。共收集1.5ml。异丙醇沉淀后，可以看见大量白色沉淀，三管合并，600ul裂解液溶解沉淀，TE稀释160倍测OD。此步共收集600ul。异丙醇再次沉淀，75％乙醇洗涤两次，尽量洗干液体，超净台干燥5min，加入100ulDEPC水溶解RNA。TE稀释40倍测OD。RNA浓度为：1.23ug/ul，共有100ul，总产量为123ug。100mg组织RNA的含量为400－700ug。5ul裂解液对OD260有非常大的影响

2、，RNA溶于水会导致OD260/280降低。产率不高的原因：1.研磨组织时有损失。2.两次异丙醇沉淀会有大量损失。3.乙醇洗涤时为避免长时间干燥，吸的很干。没有计算出回收率，改进办法：实验过程中测OD做控制时，使用5ul裂解液＋195ulTE调零。1％琼脂糖凝胶，旧的缓冲液。10ulRNA+5ulRNA酶，37℃孵育1h，加入等体积氯仿，振荡后离心取上层水相直接电泳。1.道：5ul1号管＋15ulDEP水。2.道：5ul1号管＋15ulDEP水，70℃孵育1h。3道：5ul1号管＋20ulDEP水，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩涡振荡10s，1000g离心3min，吸取上

3、层水相电泳。4道：5ul1号管＋15ulDEP水＋5ulRNA酶，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩涡振荡10s，1000g离心3min，吸取上层水相电泳。5.道：5ul4号管＋15ulDEP水。6道：5ul1号管＋20ulDEP水，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩涡振荡10s，1000g离心3min，吸取上层水相电泳。7道：5ul1号管＋15ulDEP水＋5ulRNA酶，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩涡振荡10s，1000g离心3min，吸取上层水相电。电泳结果说明：1.RNA酶有作用，代表提出的是RNA。2.37℃孵育，氯仿抽提，振荡对电泳结果没有影响，但RNA

4、有损失。RNA的消失是酶作用的，而与操作无关。3.第2道目的在于确认RNA溶液是否有残留的RNA酶。结果说明70℃孵育对结果有影响，RNA有降解。酶解后进行电泳证明确实提出了RNA，但是电泳条代还是不正常，RNA分子量偏小（在溴酚蓝附近）。两种可能，RNA在提取过程中断裂和出现降解。Trizol试剂提取RNA，2.5×106个细胞，异丙醇沉淀后看到了明显的白色沉淀，30ulDEPC水溶解后，取5ulTE稀释30倍测OD。RNA浓度为0.522ug/ul，共得到15.7ugRNA。5ul提取的RNA，1％琼脂糖凝胶，新电泳缓冲液。与前几次的电泳结果一样，还是看不到28S、18S两

5、条带。1.换了一种裂解液，但电泳结果还是很像，说明问题不出在裂解这一步。2.提取时间大大缩短，但电泳结果还是很像，说明长提取时间对结果没有影响。3.分析用到的有机溶剂，异丙醇和氯仿是在有裂解液的体系里沉淀RNA的，即使有RNA酶污染也不会降解RNA，异丙醇和氯仿污染可以被排除。剩下的就是乙醇了，两种方法里，加入乙醇操作的时间是相同的，如果乙醇有RNA酶污染，两种方法提取时RNA被裂解的效率是相同的，可以合理解释两次的电泳结果很类似。4.70℃保温实验的结果显示，RNA溶液中残留的RNA酶能把稍高分子量的RNA降解，以至于条代集中在胶的下部。产生这几次异常的电泳结果。5.还有就是

6、电泳的问题。对电泳我一直都没有想出什么办法做控制，也一直没有按照标准的RNA变性电泳来做，。下次实验的改进：1.对电泳做改进，电泳的loadingbuffer，胶，电极槽液都使用DEPC水配制。2.提取过程中除了测OD做控制外，每一步都留取样品做电泳，确定在哪一步出现降解。这样可能会有盐和蛋白的污染，蛋白污染可以通过氯仿抽提除去，盐对电泳结果应该影响不大，且可以保护RNA不被降解。