《RNA提取系列》PPT课件

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1、―核酸纯化系统TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTDRNA提取专项RNA相关知识及提取原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护AAAAAARNA相关知识及提取原理－－细胞中RNA的种类和含量AAAAAAtRNAmRNArRNARNase不同丰度组织名称样品量总RNA含量高丰度肝脏1mg2-4μg脾脏1mg心脏1mg中丰度大脑1mg0.05-2μg胚胎1mg肾脏1mg肺1mg低丰度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高丰度成纤细胞1050.5-

2、1μg人白细胞105中丰度酵母1050.5-1.5μg拟南芥叶片1mg0.2-0.5μg低丰度烟草叶片1mg0.05-0.1μg玉米叶片1mgRNA相关知识及提取原理－－RNA的裂解原理异硫氰酸胍/苯酚法细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离胍盐/β-巯基乙醇法盐酸胍裂解样本，抑制RNase的活性β-巯基乙醇变性蛋白RNA相关知识及提取原理－－RNA吸附原理吸附材料纯化原理硅基质高盐低pH

3、值结合核酸低盐高pH值洗脱阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸高盐低pH值洗脱磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附并携带RNA沉淀法介质吸附RNA相关知识及提取方法原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护RNA提取流程1、样本前处理2、细胞裂解3、RNA的纯化及获得RNA提取流程－－样品前处理注意点选择新鲜血液，不得超过4小时选择新鲜的幼嫩组织选择处于生长旺盛的时期收集细胞选择新鲜组织，生长旺盛的组织可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞然后加入一定量的TRNzol，-70℃

4、保存较长时间去掉培养基，加入一定量TRNzol-70℃保存较长时间推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存液氮或加入RNase抑制剂中保存，避免反复冻融RNA提取流程－－样品前处理中如何保存样本样品的前处理方式RNA提取流程样本前处理的目的：离散，均一，细胞集或细胞液液氮研磨匀浆或液氮研磨应用红细胞裂解液处理蛋白酶K处理RNA提取流程－－样品前处理Q&AQ-1：样品量是否越多越好？A-1：不是。在试剂盒规定内增加，若过度增加样品处理量会影响RNA得率；如增加样品起始量，则后续实验中各溶液量均要相应按比例增加。处理样品量RN

5、A得率实际得率预期得率最大量Q-2：如何保证研磨过程和匀浆中RNA不被降解？A-2：研磨过程要迅速，同时尽量避免外源RNA酶污染；匀浆过程中一定要保证组织和裂解液充分接触，尽量在匀浆前将组织低温切割成小块加入裂解液中，可确保RNA不被降解。RNA提取流程－－样品前处理Q&A1、样本前处理2、细胞裂解3、RNA的纯化及获得RNA提取流程RNA提取流程－－细胞裂解，以释放RNA异硫氰酸胍/酚－TRNzol总RNA提取试剂独特配方--RNAplant植物RNA提取试剂胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒RNA

6、提取流程1、样本前处理2、细胞裂解3、RNA的纯化及获得RNA提取流程－－RNA的纯化及获得RNA纯化要求1纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质2排除有机溶剂和金属离子的污染3蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4排除DNA分子的污染RNA相关知识及提取原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护实验举例使用试剂（以TRNzol－A＋为例）使用试剂盒（以RNApreppure试剂盒为例）操作流程样品前处理、细胞裂解试剂试剂盒纯化沉淀加入吸附柱洗涤溶解RNA沉

7、淀获得RNA产物加缓冲液漂洗RNA洗脱收集细胞基因组DNA水相有机相RNA氯仿纯化pH5.7离心加入裂解液(TRNzol-A+)实验举例－－应用TRNzol-A+提取动物细胞RNA细胞选择贴壁细胞悬浮细胞样品处理量与加入的TRNzol-A+的量要对应1mlTRNzol-A+对应：1血液0.2-1ml2动植物组织30-50mg3贴壁细胞：每10cm2培养面积4悬浮细胞：5-10×106细胞等体积异丙醇沉淀70％乙醇洗涤沉淀晾干溶解RNA吸附柱去蛋白液漂洗洗脱水相RNA传统方法：有机溶剂抽提，得率高柱纯化法：纯度高实验举例－

8、－应用TRNzol-A+提取动物细胞RNA图片说明：M:TIANGENMarkerIIIA:A公司同类产品提取动物细胞结果T:TIANGEN公司TRNzol-A＋提取动物细胞结果试验材料：Helacell/106实验方法：TIANGEN公司TRNzol-A+A公司同类产品试验结果：得率：TRNzol-A+得率与A公司