实验二、细菌染色法.ppt

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1、实验二细菌染色法一、目的要求1、掌握细菌染色标本的制备。2、掌握简单染色法、革兰氏染色法的原理及操作步骤。3、熟悉革兰染色法在鉴定细菌上的重要意义。二、基本原理细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，显示出细菌的一般形态结构及特殊结构，从而有利于对细菌标本的观察。细菌染色法可分为单染色法和复染色法两大类。1、简单染色法原理这是最基本的染色方法，由于细菌在中性环境中一般带负电荷，所以通常采用一种碱性燃料进行染色（如美蓝、碱性复红、结晶紫、孔雀绿、蕃红等）。这类染料解离后，染料离子带正电荷，故使细菌着色

2、。2、革兰氏染色法原理革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫色。革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶

3、出细胞壁，因而细胞壁被脱色，再经蕃红复染后细胞呈红色。革蓝氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较成分占细胞壁干重的%革蓝氏阳性菌革蓝氏阴性菌肽聚糖含量很高（50-90）含量很低（~10）磷壁酸含量较高（<50）无类脂质一般无（<2）含量较高（~20）蛋白质无含量较高革兰氏染色的意义细菌分类鉴定指导临床用药三、实验器材1、菌种:大肠杆菌18-24h琼脂斜面培养物、葡萄球菌18-24h琼脂斜面培养物、大肠杆菌与葡萄球菌的混合菌液。2、染液（1）简单染色液（2）革兰氏染液3、其他物品：显微镜、载玻片、香柏油、擦镜纸、酒精灯、

4、接种环、蒸馏水、染色架。四、实验步骤（一）单染色法取大肠杆菌或葡萄球菌中任一种进行单染色。（二）革兰氏染色法取另两种菌进行革兰氏复染。涂片干燥固定染色水洗镜检（一）单染色法干燥（二）细菌的革兰氏染色法染色方法结晶紫初染1min碘液媒染1min乙醇脱色番红复染1min涂片固定涂片制作水洗水洗水洗G+：紫色G-：红色方法涂片初染媒染脱色复染镜检五、思考题1、比较单染色法和复染色法的优缺点？2、革兰氏染色有哪些步骤，要注意哪些步骤？为什么？3、革兰氏染色有何实际意义？4、细菌染色结果为红色就是G-吗？为什么？5、在

5、你所做的革兰染色制片中细菌染成了何颜色？并判断是G+还是G-?微生物分类鉴定的特征形态学和生理生化特征血清学实验和噬菌体分型氨基酸序列和蛋白质分析核酸碱基组成和序列分析形态学特征培养特征、菌落的形状、大小、颜色、表面特征、光泽等细胞形态：形状、大小、排列方式特殊结构：鞭毛、芽孢、孢子、荚膜等细胞内涵物染色反应：革兰氏染色、抗酸性染色运动性球菌肺炎链球菌杆菌破伤风杆菌肉毒芽孢杆菌炭疽杆菌杆菌变形杆菌大肠杆菌绿脓杆菌螺菌钩端螺旋体幽门螺杆菌霍乱弧菌涂片菌液涂片时不需滴加生理盐水；注意练习无菌操作；取菌不要贪多，接

6、种环上肉眼可见菌苔痕迹即可；菌苔在生理盐水中涂片要均匀，局部不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性。⑴初染将涂片置于桌面上，滴加结晶紫染色液于细菌涂抹处，使其布满菌膜，染色1min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗去多余染液，甩净积水。⑵媒染滴加(Lugol)碘液覆盖菌膜，染1min，水洗。⑶脱色滴加95%乙醇于载玻片上，直至流下的乙醇无色，然后水洗（终止脱色），甩净。⑷复染滴加稀释复红染液于菌膜上，覆盖住菌膜，染色1min，水洗，甩净，最后用吸水纸轻轻吸干。干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G)

7、；被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-)。革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌1、涂片取一块干净的载玻片平放在桌面上，在载玻片中央滴一滴生理盐水（或蒸馏水）；无菌操作从试管中生长有琼脂斜面上挑取少许菌苔；将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀并涂成薄膜。注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。2、干燥将涂好菌膜的载玻片平放在桌面上，室温下自然干燥。3、固定手持已经自然干燥的涂好菌膜的载玻片，涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，热固定细菌细胞。注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破

8、坏细胞形态。4、染色将热固定的细菌涂片平放于在桌面上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。染色时间：吕氏碱性美蓝染色1~2min；石炭酸复红染色约1min草酸铵结晶紫染色约1min。5、水洗将细菌涂片上染液倒入废液缸中；手持细菌染色涂片，置于废液缸上方，用洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无色为止。注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急，过大，以免涂片薄膜