重组DNA技术.ppt

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1、第七章重组DNA技术(RecombinationDNATechnology)第一节基本概念重组DNA技术：是指在基因水平上，将目的DNA在体外重组于能自我复制的载体DNA分子上，然后将重组DNA导入宿主细胞中进行增生，以获得大量的目的DNA片段，或以此为基础，通过基因的诱导表达，得到大量相应蛋白质产物的过程。又称为分子克隆技术或基因工程技术第二节重组DNA技术的发展史基因工程的诞生1、Berg的开创性实验－第一个实现DNA重组1980年Nobel化学奖猴病毒SV40的DNA+λ噬菌体的DNA2、Boyer-Cohen实验－第一个取得基因工程成功1973年构建双重抗药性

2、重组质粒1973年是基因工程诞生的元年第三节工具酶WernerArber理论预见限制酶HamiltonO.Smith得到第一个限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片断1978年Nobel生理或医学奖1、“基因剪刀”－限制性核酸内切酶1.定义：能识别双链DNA分子中某特定的核苷酸序列，并在识别序列内或附近切割DNA双链结构的一类核酸内切酶（在核酸分子链的内部制造切口的酶）。2.来源：原核生物Ⅰ型酶、Ⅲ型酶：具有限制切割与甲基化修饰活性。Ⅰ型和Ⅲ型酶都没有多大的实用价值。Ⅱ型酶：应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点的

3、序列可知、固定。通常所说的限制性内切酶就是指Ⅱ型酶。3.分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。识别位点：即为Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列。通常是4～8个碱基对、具有回文序列的DNA片段5’–GAATTC-3’3’–CTTAAG-5’4.识别和切割位点：①5`突出粘性末端②3`突出粘性末端③平头（钝性末端）5ˊ突出黏性末端(EcoRⅠ)：3ˊ突出黏性末端(PstⅠ)：平端缺口（钝性末端）(SmaⅠ）5ˊ-G↓AATTC-3ˊ5ˊ-GAATTC-3ˊ3ˊ-CTTAA↑G-5ˊ3ˊ-CTTAAG-5ˊ+5ˊ-CTGCA↓G-3ˊ5ˊ-CTGCAG-3ˊ3ˊ-G↑ACGTC-5

4、ˊ3ˊ-GACGTC-5ˊ+5ˊ-CCC↓GGG-3ˊ5ˊ-CCCGGG-3ˊ3ˊ-GGG↑CCC-5ˊ3ˊ-GGGCCC-5ˊ+切割方式：对dsDNA2条链同时切割产生3种不同缺口2、DNA连接酶催化DNA中相邻的5ˊ端磷酸基和3ˊ-OH末端之间形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键。大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，T4噬菌体连接酶不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。ACG-OHP-AATTCGTTACTTAA-POH-GCA-ACGAATTCGT--TGCTTAAGCA3、DNA聚合酶Ⅰ具有5`→3`聚合活性、5`→3`外切酶活性、3`→5`外切酶活性。可用于合成双链cDNA

5、分子或片断连接，探针制备，序列分析等。（1）耐热TaqDNA聚合酶最适反应温度为75～80℃具有5ˊ→3ˊ外切酶活性，不具有3ˊ→5ˊ外切酶活性（3）T4DNA聚合酶：主要用于DNA的末端的标记。（4）T7DAN聚合酶长模板DNA引物的延伸反应，标记DNA。（2）逆转录酶（5）DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶裂解后产生的大片段，分子量为76kD，这个片段也称为Klenow片段（Klenowfragment）它除了保留5ˊ→3ˊ聚合酶活性及3ˊ→5ˊ外切酶活性外，失去了5ˊ→3ˊ外切酶活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3ˊ端

6、标记等。（1）5’端标记（2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸酶（CIP）。CIP能在1%SDS溶液中68℃加热15min而失活，故CIP较为常用。4、碱性磷酸酶去除DNA、RNA、dNTP和NTP5ˊ端的磷酸根。催化单脱氧核苷酸转移到DNA3`-端羟基上。应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。催化多聚核苷酸5ˊ羟基末端磷酸化。用途：⑴放射性标记DNA的5`端⑵使缺少5`-磷酸基的DNA磷酸化用于连接反应。单链核酸内切酶，降解单链DNA或RNA。6、T4多聚核苷酸激酶7、S1核

7、酸酶5、末端转移酶第四节重组DNA技术常用载体是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。一、定义分类：克隆载体：用于在宿主细胞中克隆和扩增外源DNA片段。表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因表达产物。1、具备复制能力。2、具备一个或多个筛选标志。3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位点，MCS）。5、具有较高的遗传稳定性。二、特点这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。3、常用载体质粒DNA、噬