重组质粒的构建版.ppt

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1、DNA重组质粒的构建sunyat基因克隆genecloning应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细菌或细胞、筛选出含有目的基因的转化子细菌或细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝。核心技术：DNA重组技术（recombinantDNAtechnique）基因克隆的基本程序：分—切—接—转—筛PCR酶切连接转化&转染抗性或标记筛选目的基因DNA片段的获得外源DNA分子与载体DNA分子的体外重组重组DNA分子转移到适当的受体菌或细胞重组DNA分子克隆的筛选和鉴定目的基因或其表达产物的纯

2、化和鉴定基因克隆技术的特点：1.可在体外人工的,有目的的,根据需要进行基因的重组、表达、测序、诱变、修复；2.方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。基因克隆示意图胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体例：干扰素是治疗癌症的重要物质，人血液中每升只能提取0.05μg干扰素，因而其价格昂贵。但美国有一家公司用遗传工程方法合成了价格低廉、药性一样的干扰素，其具体做法是：从人的淋巴细胞中提取能指导干扰素合成的基因，并使之与

3、一种叫做质粒的DNA结合，然后移植到酵母菌内，从而用酵母菌来产生干扰素。酵母菌能用出芽方式繁殖，速度很快，所以，能在较短的时间内大量生产干扰素。利用这种方法不仅产量高，并且成本也较低。DNA重组操作过程载体外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主细胞abbA重组Ab抗性筛选重组筛选重组质粒构建：目的DNA的PCR扩增DNA片段和载体的酶切片段DNA与载体的连接载体：plasmid（primary）工具酶：限制性内切酶连接酶常见的基因工程载体载体：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的运载工具。根据来源：plasmid;phage;viral;BAC;Y

4、AC根据用途分：克隆载体；原核生物表达载体；真核生物表达载体根据与宿主的关系分：整合性载体、非整合性载体基因工程中用得最多的是plasmid载体。下面介绍几种常见的载体。载体的基本结构单元：1.复制起点2.克隆位点3.筛选标记其他条件：4.适当大小5.易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离纯化、重组等等。质粒(Plasmid)质粒是独立于宿主细胞（如细菌）染色体之外的可进行复制和遗传的遗传单位-双链闭合环状超螺旋DNA分子。是一种环状的双链DNA分子，大小从1K-200Kb。通常质粒含有某些染色体没有的基因，负责编码某些功能蛋白，这些功能并不是细菌生存所必需的，但在一

5、定环境下，可对细菌宿主的生存有利。由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性（R因子）、产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生大肠杆菌素（大肠杆菌素因子col）、肠毒素及限制酶、修饰酶等。质粒存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。它们复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。质粒DNA的特征质粒复制依赖宿主细胞的复制机器，但可以独立复制。（单拷贝或多拷贝：紧密型质粒和松弛型质粒）严紧型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个

6、细胞中含有10-200份拷贝不相容质粒携带复制子基本相似，复制系统也相同，在复制和分配到子细胞的过程中相互竞争。质粒DNA所编码的基因产物赋予细菌某些性状特征。质粒并非细菌生存所必不可少的遗传物质，可以在细菌间转移与丢失。质粒可自行失去或经人工处理而消失可有几种质粒同时共存在于一个细菌内，但同群质粒有不相容性（同群质粒具有同源性，可以产生相同的阻遏蛋白，故彼此间有相互抑制作用，不能共存于同一细胞）（四）人工构建质粒的基本元件启始复制子：使质粒在宿主细胞中能够复制抗性基因：用于筛选阳性克隆。多克隆位点：插入外源基因。对于表达载体还需要启动子、多聚A尾等.易于操作：包括宿主

7、、转化（或转染）、分离纯化、重组等等。pBR322plasmid是一个克隆载体，作为一个克隆载体最基本的要求都具备：复制起点:Ori克隆位点:EcoRI;HindIII;BamHI;SalI筛选标记:Ampr。T-vectorPCR产物亚克隆载体T—Vector是一种高效克隆PCR产物(TACloning)的专用载体，由pUC18载体改建而成的。在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3‘端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物