DB22∕T 2784-2017 水貂阿留申病诊断 ELISA法.pdf

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1、ICS11.220B41备案号：59148-2018DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2784—2017水貂阿留申病诊断ELISA法ELISAmethodforAleutianminkdiseasediagnosis本标准仅供内部使用不得翻印2017-12-11发布2018-04-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2784—2017本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20

2、001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人：张蕾、闫喜军、张海玲、胡博、刘昊、程悦宁、白雪、赵建军、朱言柱、吕爽、薛向红、邓晓禹、史宁、鲁荣光、王洋、廉士珍。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2784—2017本标准仅供内部使用不得翻印水貂阿留申病诊断ELISA法1范围本标准规定了水貂阿留申病诊断的缩略语、原理、试剂和材料、仪器和设备、操作方法和结果

3、判定。本标准适用于水貂和雪貂水貂阿留申病的实验室检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。AD：水貂阿留申病（AleutianDisease）本标准仅供内部使用不得翻印AMDV：水貂阿留申病毒（AleutianMinkDiseaseParvovirus）ELISA：酶联免疫吸附试验（E

4、nzyme-linkedImmunosorbentAssay）OD值：光密度（OpticalDensity）TMB：四甲基乙二胺联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine）HRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase）DMSO：二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide）4原理用制备的水貂阿留申病毒抗原，包被聚苯乙烯微量板孔，使免疫反应在固相载体上进行。当备检血清中有水貂阿留申病毒抗体存在时，则与固相载体上的抗原形成抗原-抗体复合物，再与酶标记

5、的抗体（抗貂免疫球蛋白）反应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行水貂阿留申病毒抗体的定性、定量测定。5试剂和材料除有特殊说明外，所有试验用试剂均为分析纯。蒸馏水，符合GB/T6682中三级水的要求。5.1包被液，取Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，用氢氧化钠溶液调pH至9.6，蒸馏水定容至1L，采用0.5μm滤器过滤，存放于4℃冰箱。5.296孔酶标板。5.3洗涤液，pH7.4TBST缓冲液，取NaCl8.00g，KCl0.20g，Tris-base1.21g，Tween-2

6、01.00mL，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至7.4，加蒸馏水定容至1L。1DB22/T2784—20175.4封闭液，脱脂乳2.50g，TBST缓冲液定容至50mL。5.5稀释液，取封闭液用蒸馏水20倍稀释。5.6辣根过氧化物酶标记的山羊抗雪貂IgG。本标准仅供内部使用不得翻印5.7TMB底物缓冲液，A液：NaH2PO3·H2O，27.60g，加蒸馏水定容至1L。B液：Na2HPO3·2H2O，25.60g，加蒸馏水定容至1L。取A液87.70mL，B液12.30mL，混匀。5.8TMB底物显色

7、剂，取TMB粉60mg，溶于10mLDMSO中。5.9TMB底物显色液，TMB底物缓冲液10mL，TMB底物显色剂100μL，H2O215μL。临用前配制。5.10终止液，取浓盐酸用蒸馏水12倍稀释。5.11抗原的制备见附录A。5.12备检血清、阴性血清和阳性血清的制备见附录A。6仪器和设备6.1酶标仪，含有450nm波长的滤光片。6.2移液器，200μL～1000μL、20μL～200μL。6.3洗板机。6.4恒温培养箱，37℃。6.5冰箱，温控范围0℃～4℃。7操作方法本标准仅供内部使用不得

8、翻印7.1将纯化的AMDV抗原（附录A.1）用包被液(5.1)稀释至20μg/mL，100μL/孔(5.2)，4℃密封过夜。7.2次日用洗涤液(5.3)洗涤3次，加入200μL/孔的封闭液(5.4)，37℃孵育2h。7.3用洗涤液洗涤3次，加入1:20稀释的被检血清样品(附录A.2)，100μL/孔，同时设阴性血清(附录A.3)、阳性血清(附录A.4)和空白对照孔（5.5），每个样品设重复孔，室温孵育1h。7.4用洗涤液洗涤3次，加入用稀释液(5.5)做1:4000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊