蛋白质组学研究中傅立叶变换离子回旋共振质谱数据采集方法的比较.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第9期2010年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1238～1242DOI：10．3724／SP．J．1096．2010．01238蛋白质组学研究中傅立叶变换离子回旋共振质谱数据采集方法的比较曾家伟贾伟应万涛钱小红(军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京蛋白质组研究中心，蛋白质组学国家重点实验室，北京102206)摘要探讨了线性离子阱一傅立叶变换离子回旋共振质谱(LTQ—FT)的数据采集模式对蛋白质组鉴定结果的影响，比较和分析了针对不同复杂程度样本的最佳采集模式。

2、对于O／一乳清蛋白4种标准蛋白质酶切肽段混合物的简单体系，在傅立叶变换离子回旋共振腔中选3个最强母离子进行选择离子监测扫描后，再实施二级碎裂的方法(SIM3)得到的肽段覆盖率，分别是直接选10个最强母离子进行二级碎裂(FF10)方法得到的肽段覆盖率的1．5～1．9倍。另外，对酵母蛋白酶切肽段混合物的复杂体系鉴定时，只采集双电荷和三电荷母离子进行二级扫描的方法(FT10_23)比单电荷、双电荷和三电荷都采集的方法(FrlO一123)得到的图谱鉴定成功率提高64．1％。实验还对不同数据采集模式下图谱的特点进行了考察。本研究表明，针对不同复杂程度的样本，应采取

3、不同的质谱数据采集方法。关键词蛋白质组学；质谱采集模式；线性离子阱一傅立叶变换离子回旋共振质谱1引言蛋白质组学分析的样本极其复杂，准确度与扫描速度哪一个可以产生更为理想的数据结果是一个非常基础和非常重要的方法学问题¨卫J。在以肽段为直接鉴定目标的Shotgun蛋白质组研究策略中，离子阱型质谱以其高灵敏度、高扫描频率得到了广泛应用’。新型的离子阱质谱层出不穷，但由于其设计原理的局限，准确度和分辨率还不理想。而傅立叶变换回旋共振质谱，可以提供超高的准确度(1～2ppm)和分辨率(500000FWHM以上)。但缓慢的扫描速度却使其长期以来无法应用于大规模的蛋白

4、质组研究。混合型质谱Linearquadrupoleiontrap／FT—ICR(LTQ—FF)，将离子阱质谱与傅立叶变换回旋共振质谱巧妙地结合，使之兼具了这两种质谱仪的优点：高扫描速度、高灵敏度、高准确度及高分辨率。这类混合型质谱成为大规模蛋白质组分析中最有力的工具之一J。本研究针对LTQ—FT质谱不同采集方法的特点，设计实验，总结出适合不同复杂程度样本的采集方法。2实验部分2．1仪器与试剂真空冰冻干燥机SC100ASpeedvacPlus(美国ThermoSavant公司)；线性离子阱．傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(LTQ．fTr，美国ThermoF

5、isher公司)；超纯水由Millipore纯水系统(美国Millipore公司)制备。Ot哥L清蛋白、碳酸酐酶2、3．磷酸甘油醛脱氢酶、卵白蛋白和啤酒酵母干粉蛋白(Sigma公司)；乙腈(ACN，HPLC级，美国Fisher公司)；三氟乙酸(TFA)、甲酸(FA)、碘乙酰胺(IAA)和二硫苏糖醇(DTF)(比利时ACROS公司)；胰蛋白酶(Trypsin，Sequencinggrade，Promega公司)；其它试剂为国产分析纯。2．2实验方法2．2．1标准蛋白酶切取一乳清蛋白、碳酸酐酶2，3-磷酸甘油醛脱氢酶和卵白蛋白各200g，溶于100L含有8m

6、ol／L尿素、10mmol／LDTT和50mmol／LNHHCO溶液中，置37℃水浴中还原4h，然后加入5txL1mol／L碘乙酰胺放置暗处1h进行烷基化，加900IxL50mmol／LNHHCO溶液将尿素稀释到0．8mol／L，最后加入16g胰蛋白酶，在37℃保温反应16h。2009—12-21收稿；2010-02-08接受本文系围家重点基础研究计划项目(Nos．2007CB914100，2010CB912700)、国家重大创新药物创制专项(No．2009ZX09301-002)、国家自然科学基金重点项目(Nos．20735005，20635010)资

7、助项目}E—mail：qianxh@nic．bmi．ac．cn第9期曾家伟等：蛋白质组学研究中傅立叶变换离子回旋共振质谱数据采集方法的比较12392．2．2酵母蛋白酶切取啤酒酵母干粉200mg溶于1mL50mmol／LNHHCO，超声15min，40000g离心1h。取上清液，冻干，加入Loadingbuffer(50mm01／LTris—HC1，2％SDS，10％Glycerol，0．1％溴酚蓝)煮沸10min。4％～12％SDS—PAGE分离，考马斯亮蓝染色，分子量60～110kDa范围条带胶上酶切。2．2．3液相分离条件将脱盐后的酶切肽段用A相复溶

8、，15000g离心10min后上样。流动相A：0．1％FA一98％水溶液；流动相