Western-Blot实验(蛋白质印迹法).pptx

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1、WB实验细节详述时间：2016-05-07一：蛋白定量（实验前处理）组织：到手的组织状态：冰袋快递：组织腐烂，蛋白含量减少干冰快递：基本无影响甲醛处理：石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒需用匀浆器，液氮等方法加入1*PBS充分研磨裂解液量：组织（g）：裂解液（ml）=1:10细胞：一般为细胞悬液实验前需确定细胞大概浓度裂解液量：107数量细胞加入1ml裂解液一：蛋白定量（裂解液详述）裂解液使用时加入PMSF：1ml裂解液加1ulPMSFPMSF（苯甲基磺酰氟）是一种蛋白酶抑制剂，可抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶

2、，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）PMSF在水液体溶液中不稳定，见水易分解，需使用前加入。RIPA裂解液：（100ml体系）试剂名称配方作用Tris(pH7.4)50mM生物缓冲液NaCl150mM让蛋白处于正常条件下，避免蛋白构象改变TritonX-100中性去垢剂1%保持蛋白天然构象，提高细胞膜的通透性sodiumdeoxycholate（脱氧胆酸钠）阴离子去垢剂1%裂解细胞，溶解蛋白（尤其是难溶于水的膜蛋白）SDS阴离子去垢剂0.1%破坏蛋白分子的二、三级结构使分子被解聚成多肽

3、链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。一：蛋白定量（原理）在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此制作标准曲线做对比，即可计算待测蛋白的浓度。一：蛋白定量（实验过程）加标样+水（共10ul）样品5ul+水5ul混匀放置37℃培养30min,测OD值，562nm标样(ul)01246810

4、水(ul)10986420加入200ul（A+B)工作液，A液：B液=50:1一：蛋白定量（数据处理）OD蛋白浓度（ug/ul）最大上样量为35ul蛋白浓度30ug保证每个孔蛋白量相同二：聚丙烯酰胺凝胶电泳（配胶）分离胶试剂分离胶浓度6%8%10%12%15%18%分子量（kDa)≥9470-9455-7020-5510-20≤10去离子水（ml）5.34.64.03.32.31.330％丙烯酰胺（ml）22.73.34.05.06.01.5MTris－HCl（PH8.8）（ml）2.52.52.52

5、.52.52.510％SDS（ml）0.10.10.10.10.10.110％AP（ml）0.10.10.10.10.10.1TEMED（ul）0.0080.0060.0040.0040.0040.004总体积（ml）10ml（两块胶的量）作用：使蛋白样品分离对于分离胶来说，pH8.8与甘氨酸的pka接近，从而使不同分子量的蛋白产生不同的泳动速度，从而使不同分子量的蛋白分开。二：聚丙烯酰胺凝胶电泳（配胶）浓缩胶作用：使蛋白样品浓缩对于浓缩胶来说，pH6.8可以通过甘氨酸和和氯离子的作用产生压缩，从而使

6、蛋白条带压细。试剂浓缩胶浓度5%水（ml）230％丙烯酰胺（ml）0.51.0MTris－HCl（PH6.8）(ml)0.3810％SDS（ml）0.0310％AP（ml）0.03TEMED（ul）0.03总体积（ml）3（两块胶的量）制分离胶时10%AP加入后迅速混匀再加TEMED制胶，沿壁灌注，灌注时尽量不要产生气泡，如有气泡，用移液器将气泡吸出，留出浓缩胶所需空间（梳齿长再加1cm）。覆盖水层于分离胶溶液上，夏天将制胶器放室温20min，冬天放37度培养箱20min-30min待分离胶和水层之间

7、会出现清晰界面，表明分离胶充分聚合（可微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合），倒掉并用滤纸吸干水在已聚合分离胶上直接灌注浓缩胶液体，立即插入加样梳（缓慢插入，避免产生气泡）。将凝胶在室温或者37℃静置20-30min（视具体情况而定），直到浓缩胶完全凝固。二：聚丙烯酰胺凝胶电泳（配胶）配胶过程要点：灌制分离胶隔绝空气灌制浓缩胶插入梳子二：聚丙烯酰胺凝胶电泳（原理）主要依据蛋白质的分子量对其进行分离SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度

8、与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间