庆阳豆豉优势菌株的分离鉴定-论文.pdf

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1、庆阳豆豉优势菌株的分离鉴定彭昀，杨富民，康红霞，孟红霞(甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州，730070)摘要为了确定庆》13豆豉的主要作用微生物，获得优势发酵菌株，以甘肃庆阳7个县区农户所制的发酵豆豉为材料，采用不同培养基分离纯化，通过平板透明圈法初筛，发酵液蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶活性测定，对传统豆豉发酵微生物进行了分离筛选，最后对优势菌株进行生理生化鉴定及16SrDNA分子生物学鉴定。共分离出22株细菌菌株，初筛获得10株均可分解蛋白质、淀粉和纤维素能力的菌株，其中QY2b蛋白酶和纤维素酶活性最高，分别达到了25．3

2、7U／mL和6．015U／mL。通过对QY2b的形态观察及生理生化试验，结合16SrDNA鉴定手段，确定该优势发酵菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。关键词庆阳豆豉，细菌，优选菌株，16SrDNA鉴定甘肃庆阳地区农户自制的传统豆豉，具有良好的THZ-82N型台式恒温振荡器，上海森信实验仪器有品质和独特的风味，说明其中拥有优良的发酵微生物限公司；DYY一8型稳压稳流电泳仪，上海琪特分析仪菌群，这些微生物能产生较高活性的蛋白酶、纤维素器有限公司；YXJ-2离心机，湘仪离心机仪器有限公酶和淀粉酶等酶系，从而较好地分

3、解大豆中的蛋白司；H6．1微型电泳槽，上海精益有机玻璃制品仪器质、纤维素和淀粉等物质，产生独特的风味物质。笔厂；凝胶成像系统，GeneGenius公司；U一3010紫外．可者采用不同培养基，从豆豉曲中分离出主要发酵微生见分光光度计，Hitachi公司；移液器，加拿大BBI公物，用平板透明圈法，考察其分解蛋白质、纤维素和淀司；PCR反应扩增仪，加拿大BBI公司；3730测序列粉的能力，对具有分解优势的菌株的发酵液进行蛋白分析仪，美国ABI公司。酶、纤维素酶和淀粉酶的活性测定，从而得到优选菌1．1．3培养基株牛肉膏蛋白胨培养基(用于

4、细菌的分离培养)：牛肉膏1．5g，蛋白胨5g，NaC12．5g，琼脂8g，H：O1材料与方法500mL，pH7．2～7．4。1．1材料孟加拉红培养基(RBA)(用于霉菌的分离培1．1．1样品养)：虎红培养基12．7g，HO400mL。甘肃庆阳地区农民家中自制豆豉的豉曲(采自LB液体培养基：胰蛋白胨5g，NaC15g，酵母浸甘肃省庆阳市庆城、环县、华池、镇原、宁县、正宁、合出汁2．5g，H2O500mL，pH7．0。水7个不同县区)，编号分别为QY1至QY7。酪蛋白琼脂培养基：酪蛋白5g，葡萄糖1g，酵母豆豉制作工艺流程：黄豆一浸

5、泡去皮一蒸煮(2浸出汁1g，琼脂8g，KHPO41g，KH2PO0．5g，Mg—～3h)一沥干一装入容器一自然发酵(30～40℃发SO40．1g，H2O500mL，pH7．2～7．4。酵5～6d)。纤维素琼脂培养基、淀粉琼脂培养基参照文1．1．2仪器与设备献中的方法配制。VD．650．U单人洁净工作台，苏州安泰空气技术厌氧培养基：酪素水解物10g，NaCI2．5g，硫代有限公司；YX280型普通手提式灭菌锅，上海三申医乙醇酸钠1g，甲醛次硫酸钠0．5g，琼脂8g，H：O500疗器械有限公司；DRP一9302型电热恒温培养箱，上海

6、mL。森信实验仪器有限公司；NikonECLIPSEEl00光学柠檬酸盐利用培养基：NaC10．5g，MgSO·7H：O显微镜；PB一203N型电子天平，上海精密科学仪器厂；0．02g，NHHPO40．1g，K2HPO4·3H2O0．1g，柠檬酸钠0．2g，1％溴百里酚蓝1mL，琼脂1．2g，HO99第一作者：硕士研究生(杨富民教授为通讯作者)。mL，pH7．0。收稿日期：2013—01—27，改回日期：2013—03—12M．R与V．P试验用培养基：蛋白胨5g，葡萄糖558I2—013Vo1．39No—．4(Total304g

7、，NaC15g，H2O1000mL，pH7．0～7．2。1．2．7复筛糖发酵培养基：蛋白胨2g，NaCI5g，KHPO0．2将同时具有分解蛋白质、纤维素、淀粉能力的菌g，葡萄糖(或蔗糖或乳糖)10g，琼脂6g，1％溴百里株菌悬液，以2％的比例接种至装有20mLLB液体酚蓝3mL，H，O1000mL。培养基的三角瓶中，37℃、150r／rain培养48h，制成1．2方法发酵液，3000r／rain离心20min，测定发酵上清液中1．2．1操作流程蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶的活力。取样一制备菌悬液一平板涂布一单菌落分离纯蛋白酶活性的测

8、定：参照GB／T23527—2009化一菌种活化一初筛一复筛一菌种鉴定一保藏。福林法测定样品中性蛋白酶的活性；纤维素酶活性的1．2．2菌悬液的制备测定：参考郑哲方法，测定纤维素内切酶(CMC酶)将7个豆豉样品分别称取5g，碾碎后加入装有的活力；淀粉酶的活性测定：