[精品]15种蛋白质单晶培养的方法.doc

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1、15种蛋白质单晶培养的方法：(1)大量养晶法(bulkcrystallization)：若急着养出单晶,则将纯化之蛋白质溶液加入固体盐类或饱和盐液，直到溶液屮出现乳白混浊色，离心后把上清液(suppernatant)放置数天至数周，有可能养出单晶。(2)j比次养晶法(batchmethod):若发现加入蛋口质的沉淀剂和盐类等化学药殆，在浓度C1产生沉淀，浓度Cn为液体，则在C1至Cn之间细分成一串浓度C1>C2>C3>...>Q>Cn,(n-2)个小试管进行养晶，可能结出单晶。此法之主要缺点在于蛋白质的消耗量大。(3)大量透析法(bulkdialysis)：把蛋白质溶液包在半透膜(membr

2、ane)内，浸入盛有化学药品的器皿屮，半透膜能让小分子进出，却不会让蛋白质等大分子通过，则器皿屮沉淀剂、盐类和有机溶液等化学药品会穿过半透膜，与蛋白质起作用，直到膜之内外的浓度梯度(concentrationgradient)降到零为止。此法的好处在于，器皿屮化学药品之浓度可作连续之调整，pH值的范围也可探讨。坏处是膜之内外浓度差异减少时，平衡速率也随之降低。(4)微量透析法(microdialysis):把半透膜的体积缩小，绑在比钮扣略大的衬架上，架体之凹槽内注入蛋白质溶液，色覆半透膜的体架放入盛有化学约品的器皿，其养晶原理与大量透析法相同，只是使用蛋白质和化学药品的量放得少。注意凹槽内不

3、得留有气泡，否则膜外的化学药品为气泡所阻止而无法透过气泡，渗入膜内的蛋白质溶液。(5)连续萃取(sequentialextraction)：此法所根据的原理是亚可比(Jacoby)的实验，他发现蛋白质在硫酸钱溶液屮溶解度随温度的提升而下降。在4°C以下取得上清液(supernatant),放在室温长晶。先将蛋白质溶液加入固体硫酸鞍或饱和硫酸鞍液体，使蛋白质溶液沉淀，离心除去上清液。接着保持4°C以下处理一系列的蛋白质沉淀物。准备数种依次递降浓度的沉淀剂(通常为蒸锚水)，浓度高的沉淀剂先加入上述蛋白质沉淀物屮，以玻棒搅拌并离心，取出上清液，放在室温养晶，再把浓度次高的沉淀剂加入上次未完全溶解的

4、蛋白质沉淀物，搅拌离心，把上清液置于室温养晶，依次类推，直到蛋白质全部溶解为止。这样每次取出的蛋白质浓度依次递减，溶液由低温移至高温，符合亚可比的准则，可能养出蛋白质单晶。(6)自由接口间的扩散法(freeinterfacediffusion)：若蛋白质在不同的溶剂中具有不同的溶解度，则蛋白质注入盛有沉淀剂试管的上方或下方(依密度而定，西度大者放在下方)，在两种溶液的交界面扩散会有晶核长出，装置如图7・10所示。(7)凹盘或玻片上的蒸汽扩散法(vapordiffusiononplatesorslides)―座滴法：蛋白质养晶的要领在于蛋白质达成过饱和溶液，同时添加的化学药物与蛋白质起作用，协

5、助晶核的形成。掺有化学纱品的蛋白质溶液，其水分慢慢扩散，达到过饱和溶液则有可能长出单晶。若蛋白质溶液暴露在空气屮，水分蒸发掉，则蛋白质干涸，无法形成单晶，原因是蛋白质单晶约略维持液态的结构，含有大量水分，水分与蛋白质间形成许多氢键，水分蒸发，蛋白质也无以为系，因此必须保持水分，使蛋白质溶液密闭在一个容器小。同吋还得调节水分，所以必须置放两种溶液，使蛋白质溶液屮的水分扩散到另一种高浓度的溶液屮，以达蛋白质溶液的过饱和。通常选择适肖的盐类和有机溶剂，调在等电点的pH值，形成沉淀剂，把粉晶蛋白质泡成一定浓度，约在5〜40mg/ml之间，在凹盘的下凹孔镀硅,注入一些蛋白质溶液和沉淀剂总共10〜40m

6、

7、。在凹盘外方的塑料盒，倒入20〜30ml的沉淀剂。在塑料的四周涂真空油膏(Vacuumgrease),加以密封。通常这样的燃料盒对于每种养晶条件制备两盒，一盒放在4°C的低温，另盒放在室温,待其长晶，快则一周，慢则数月，幸运的话，可望长出单晶。通常一次制备数拾条件，人量养晶。要鉴定长出的单晶确实是蛋白质而不是滴入的沉淀剂等化学药品。若养出蛋白质单晶太小，不足以供X光绕射实验使用，则可使用连续播种法把小晶粒养大：依照养出蛋白质小单晶的条件，炮制母液(蛋白质溶液配合沉淀剂)，注入凹孔，外围倒注沉淀剂，加以密封，等待约半天后，打开封盖，把以前所养的小晶粒稍加清洗后放入，企图长大，若长出的晶体仍然

8、不符X光使用，则把最后一次的晶体当新晶种，再继续播种，直到晶体够人。此种养晶法的好处是：用量少，筛选多种条件相当理想;易于修饰塑料盒内沉淀剂的浓度。此种养晶法装置，也可用具有凹槽的玻片来取代，在其一凹孔注入10ml的母液，另一凹孔注入20〜40mI的沉淀剂，以小玻片密封，等待长晶。(1)悬滴液蒸汽扩散法(vapordiffusioninhangingdrops)—悬滴法:它在原理上和座滴法相同，皆以蒸汽达到平