蛋白质分离纯化.ppt

《蛋白质分离纯化.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、蛋白质分离纯化蛋白质的分离纯化（一）材料1、选材2、破碎3、混合物的分离（二）粗分级（三）细分级（四）结晶样品的前处理1、生物样品的选择和处理样品的选择：有效成分含量高、来源丰富、保持新鲜、实验条件恒定、取材工艺简单、有综合利用价值等。处理：包括去除脂肪、结缔组织等。2、细胞破碎：机械破碎法、物理学方法、化学法、酶学法3、抽提（extraction）：是指在一定条件下，用适当的溶剂和方法，使有效成分充分溶解到溶剂的过程。蛋白质的分离方法根据蛋白质的溶解度差异分离—沉淀技术根据蛋白质分子大小的差异分离根据蛋白质的荷电差异分离根据蛋白质与某些

2、物质的吸附差异—吸附分离利用生物分子专一性结合的特性—亲和层析根据蛋白质的溶解度差异分离—沉淀技术可逆沉淀：等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀不可逆沉淀：热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀1、根据溶解度不同（1）盐析（saltingout）1）定义：在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高这种现象称为盐溶（saltingin），但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降，直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析（saltingout）。2）原理Saltingin：蛋白质吸附某种离子→蛋白质彼此排斥，而蛋白质与水相互作用加强→溶解度提

3、高。Saltingout：大量中性盐加入→破坏蛋白质分子表面的水活膜，降低水的活度，蛋白质表面的电荷被中和→蛋白质相互聚集而析出。3）盐析中最常用的盐是：(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4，尤其以(NH4)2SO4为最佳。原因：(NH4)2SO4溶解度大而温度系数小，分离效果好，能保持蛋白质的天然构象，且价廉可得，这是蛋白质粗提纯的一种最常用方法。（2）等电点沉淀法1）pH偏离pI时，蛋白质带相同符号的净电荷而互相排斥→蛋白质溶解度大。2）pH=pI时，蛋白质的净电荷为0→蛋白质聚集沉淀3）等电点沉淀法的缺点：沉淀不完全。（3）

4、有机溶剂沉淀法1）原理：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜。2）注意：高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。2、根据分子大小不同（1）透析和超滤1）透析（Dialysis）：就是利用蛋白质分子不能通过半透膜（Semipermeablemembrane）而小分子可以自由透过的性质，使蛋白质与小分子物质分开。作用：脱盐、无机离子和小分子物质等。透析膜：动物膜、羊皮纸、火棉胶、赛璐

5、玢或其他材料等。透析——只用于除盐类和小分子杂质透析——只用于除盐类和小分子杂质2）超滤（ultrafiltration）：是利用压力和离心力，借助于超滤膜将不同分子量的物质分离的技术。Ultrafiltration的功能：纯化和浓缩（同PEG，聚乙二醇）。Ultrafiltration膜：丙烯氰、醋酸纤维素、硝酸纤维素和尼龙等。超过滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液（2）凝胶层析又叫分子筛层析。分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。具备条件：1、惰性

6、，2、水不溶性，3、能高度水化。常用分子筛：葡聚糖凝胶（Sephadex）型号：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15分离大蛋白质、小蛋白质，除盐琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）孔径大，用于分离大分子物质聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）原理：1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快；2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。（3）密度梯度离心原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒

7、各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。密度梯度离心滴加样品4%8%12%16%20%塑料离心管蔗糖密度梯度（介质还可用：氯化铯、甘油等）蔗糖浓度%分子量由小—————大3、根据带电性质不同电泳法离子交换层析（1）电泳法类型：1、区带电泳纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。2、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。垂直板电泳垂直板电泳垂直板电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯

8、酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚