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《猪瘟病毒中国标准强毒株_F114株全长cDNA的构建.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、41卷4期微生物学报Vol.41No.42001年8月ActaMicrobiologicaSinicaAugust20013猪瘟病毒中国标准强毒株———F114株全长cDNA的构建33聂玉春柯叶艳陈建国丁明孝(北京大学生命科学学院北京100871)摘要:应用RT2PCR技术,分段克隆了猪瘟病毒中国标准强毒株F114株的全基因组,经测序验证,用DNAman软件比较分析与其它几个代表毒株的同源性,发现与Brescia、Alfort及C株核苷酸序列同源性分别为96180%,86103%和95170%,氨基酸序列同
2、源性分别为98154%,+93133%和97141%。将各段cDNA连接到pGEM2T和pBluescriptⅡsk质粒,得到两个亚克隆+sk20164(即sk质粒中插入片断为1～6441nts,依次类推)和sk264122,再将两个亚克隆连接成sk212297,即CSFV全长cDNA克隆。关键词:猪瘟病毒,全长cDNA,序列同源性中图分类号:S852165文献标识码:A文章编号:000126209(2001)0420452205猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus,CSFV)是引起猪
3、高度传染性疾病———猪瘟的致病原,与羊边界病病毒(BorderDiseaseVirus,BDV)、牛病毒性腹泻病病毒(BovineViralDiar2rheaVirus,BVDV)一起构成黄病毒科的瘟病毒属。猪瘟病毒是基因组长约1213kb的正链RNA病毒,一个大ORF编码约3900个氨基酸多肽,在翻译过程中或翻译后被加工成结构[1,2]和非结构蛋白。尽管猪瘟病毒仅编码11～12个蛋白,但它与宿主细胞的相互关系比较复杂,其致病相关蛋白方面的研究缺乏有力证据,研究猪瘟病毒的致病机理进展缓慢。从全长cDNA恢复
4、有活性的病毒粒子这一手段的成熟及应用,是研究病毒的致病因子、RNA复制、病毒基因产物的功能、阐明病毒的致病机理等极具价值的工具。目前已在多种正链RNA病毒中成功应用。国外文献已报道了构建CSFV的C株和AlfordP187株、BVDV的NALD株等的全长cDNA,并用于研究病毒单个蛋白的功能,取得了一些可喜进[3～5]展。本实验用我国标准强毒株(石门株)为材料,构建了CSFV全长cDNA,为研究猪瘟病毒增殖、致病机理及中国强弱毒株之间的关系提供了理想的材料。1材料和方法1.1病毒与细胞石门株F114脾淋毒(
5、购自中国兽药监察所),在PK215细胞上复壮至第五代,差速离心法纯化病毒,用盐酸胍裂解法提取RNA,用于RT2PCR。112载体与引物+所用载体有pBluescriptⅡsk、pGEM2T和pET228a等。Taq酶Elongasesvstem、反转录3国家攀登计划资助项目(No.85244202205)和国家重点基础研究发展规划项目(G1999011904)资助33通讯作者作者简介:聂玉春(1973-),男,安徽和县人,北京大学博士研究生,从事病毒分子生物学和细胞生物学研究。收稿日期:2000207224
6、,修回日期:20012012124期聂玉春等:猪瘟病毒中国标准强毒株———F114株全长cDNA的构建453酶SuperscriptⅡ和T4DNA连接酶均购自LifeTechnology,Inc.,限制性内切酶购自NEB和Promega公司根据已发表的猪瘟病毒C株及Brescia序列设计引物,由塞百盛生物公司合成。引物名称为“P”表示上游引物“,N”表示下游引物,数字表示引物5’端对应的病毒基因组中碱基位置。P1:AGATTGAATTCGTCGACTAATACGACTCACTATAGTATACGAGGTTA
7、GTTCATTCTCN1298:GGACTCCTTTGCATATTTTTTCCGGC1P1172:CGGGATCCATGGCCGAAAATATAACTCAN3475:ATTTGTTGTCTTGGTGGTGTGAGAATTCCGP3231:AGGTGCATGCATCAGATGAAAGATTGGGCCP5106:GAAGATCTATGGGAGATTTGGAACACCTTGN5711:AAGCTT-ATGAGTGGAATACAAACAGP6436:CCTGAGGATCCATCTAACCTN6441:GATGGAT
8、CCTCACCACTATP8660:GGTTCATTTCTCTGCATAAATAAATTCGGGN8690:CCCGAATTTATTTCTGCAGAGAAATGAACCP9909:GGGGATCCATGAAACTGAGTAATTGGGTGATGCAAGN10721:CGGAATTCTCAGGCGGTCCAGTCATCGTTN12297:GATCTAGAGCCCGGGCCGTTAGAAATTCCC113RT2PCR
