DB34∕T 1943-2013 猪瘟病毒强毒株与疫苗株鉴别检测套式RT-PCR方法.pdf

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1、ICS11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T1943—2013猪瘟病毒强毒株与疫苗株鉴别检测套式RT-PCR方法MethodofdetectionanddifferentiationofvirulentandvaccinestrainsofclassicalswinefevervirusbynestedRT-PCR2013-08-28发布2013-09-28实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1943—2013前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽安泰农业开发有限责任

2、公司、安徽浩翔农牧有限公司、蚌埠市八大集种猪场提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽安泰农业开发有限责任公司、安徽浩翔农牧有限公司、蚌埠市八大集种猪场。本标准主要起草人：孙裴、李郁、魏建忠、朱良强、殷宗俊、杨勇、何长生、高亚飞、占松鹤、曾祥明、秦娟。IDB34/T1943—2013猪瘟病毒强毒株与疫苗株鉴别检测套式RT-PCR方法1范围本标准规定了猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）野毒株与疫苗株鉴别检测的套式RT-PCR方法。本标准适用于猪瘟的诊断和

3、监测，适用于猪活体及其脏器、血液、排泄物和细胞培养物中CSFV核酸的检测及野毒株与疫苗免疫毒株的鉴别。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T27540猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1强毒株能使猪产生临床症状和死亡的猪瘟病毒株称猪瘟病毒强毒株。3.2疫苗株能够引起机体免疫应答，但不能或轻微能使猪产生临床症

4、状的猪瘟病毒株称猪瘟病毒疫苗株。4试剂和材料4.1试剂除另有说明，所有试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。4.2TrizolRNA提取试剂，包装瓶用锡箔纸包裹，于4℃～8℃保存。氯仿：4℃预冷。4.3异丙醇1DB34/T1943—20134℃预冷。4.475％乙醇用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。4.5DEPC水去离子水中加入0.1％DEPC，37℃作用1h，（121±2）℃，高压灭菌15min。4.6RNA酶抑制剂（30U/μL）。4.710×PCRbuffer（10mmol/LpH8.3Tris-HCl，50mmol/LK

5、Cl，1.5mmol/LMgCl2）。4.8dNTP（2.5mmol/L）。4.9用于RT-PCR反应的引物浓度为10μmol/L，其序列如下：——套式第一步上游引物F1：5-GTAGCAAGACTGGRAAYAGGTA-3,Y=C或T,R=A或G；——套式第二步上游引物F2：5-ACCCTRTTGTARATAACACTA-3，Y=C或T,R=A或G；——共用下游引物R：5-AAAGTGCTGTTAAAAATGAGTG-3。4.10反转录酶SuperscriptⅢ反转录酶（200U/μL）4.11DNA聚合酶TaqDNA聚合酶（5U/μL）4.12阴性对照

6、DEPC水。4.13阳性对照中国猪瘟兔化弱毒疫苗（C株）、标准Shimen强毒株。5器材和设备5.1高速台式冷冻离心机：最大离心力12000g以上。5.2冰箱5.3PCR检测仪5.4组织匀浆器5.5微量移液器和吸头5.6离心管5.7样品的采集6样品的采集6.1采样注意事项2DB34/T1943—2013采样及样品前处理过程应戴一次性手套，样本不得交叉污染。6.2采样工具扁桃体采样器：鼻捻子、开口器和采样枪。使用前均应用3％氢氧化钠溶液浸泡消毒5min～10min，经清水冲洗。灭菌牙签和0.5mL或1.5mL离心管经（121±2）℃，高压灭菌15min；剪刀

7、、镊子经160℃干烤2h。6.3采样方法6.3.1活体样品固定活猪的上唇，用开口器打开口腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌牙签挑至0.5mL或1.5mL离心管并作标记，编号，送实验室。取待检样品，按1:5倍体积加入DEPC水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，3000g离心15min，取上清液转入离心管中编号备用。6.3.2内样样品采取病死猪各种脏器（淋巴结、脾脏、肝脏、回肠、肾脏）装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。取50mg～100mg待检样品，按1:5倍体积加入DEPC水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，3000g离心15min，取上清液转入离

8、心管中编号备用。6.3.34％EDTA抗凝血用无菌注射器抽取全血，