FQ-PCR联合Sanger测序法检测结直肠癌患者表皮生长因子受体、KRAS及BRAF基因突变-论文.pdf

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1、·1086·中国生物制品学杂志2014年8月第27卷第8期ChinJBiologicalsAugust2014，V01．27No．8技术方法FQ—PCR联合Sanger测序法检测结直肠癌患者表皮生长因子受体、KRAS及BRAF基因突变程鹏飞，林佳一，唐景峰2,3,41．武汉大学医院，湖北武汉430072；2．基因诊断与肿瘤个性化治疗湖北工程研究中心，湖北武汉430070；3．武汉百泰基因工程有限公司，湖北武汉430070；4．武汉大学病毒学国家重点实验室，湖北武汉430072摘要：目的建立实时荧光定量PCR(fluorescentquantitat

2、ivePCR，FQ．PCR)联合Sanger测序法快速检测结直肠癌患者表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)、KRAS和BRAF基因突变的方法。方法根据结直肠癌中EGFR、KRAS和BRAF基因常见突变类型设计引物及其TaqMan探针序列，以提取的86份结直肠癌患者肿瘤组织DNA为模板，进行FQ．PCR扩增，PCR产物经SAP酶和EXOI酶作用后，收集酶切产物，进行测序PCR扩增，扩增产物经乙醇／醋酸钠法纯化后进行测序，测序结果采用Bioedit软件进行分析；检测EGFR、KRAS及BRAF基因突变

3、，并与FQ．PCR法检测KRAS12／13密码子突变进行比较。结果成功建立了FQ．PeR联合Sanger测序法检测结直肠癌患者样本中EGFR、KRAS和BRAF基因突变的方法，各基因PCR扩增曲线均为标准的“s”型荧光扩增曲线，测序峰图清晰、稳定。86份结直肠癌样本中，EGFR基因突变概率2．3％(2／86)，均为第2l号外显子点突变，突变类型为L858R和L861Q；KRAS基因突变概率33．7％(29／86)，其中第12位密码子突变占79．3％(23／29)，突变类型为G12D和G12V，第13位密码子突变占10．3％(3／29)，突变类型为G

4、13D，第l2和l3位密码子同时突变1例(3．4％)，第61位密码子未检测到突变，第146位密码子仅检测到2例突变，占6．9％(2／29)，突变类型均为A146V；BRAF基因未检测到突变。FQ—PeR法检测KRAS12／13密码子突变概率高于rQ—PCR联合Sanger测序法，但差异无统计学意义(P>0．05)，两种检测方法的总体符合率为97．7％(84／86)。结论实时FQ—PCR联合Sanger测序法可快速检测结直肠癌患者中EGFR、KRAS和BRAF基因突变，检测方法稳定、可靠。关键词：荧光定量PCR；结直肠癌；基因突变；测序中图分类号：R

5、735．3+7Q789文献标识码：A文章编号：1004—5503(2014)08．1086—06Testforepidermalgrowthfactorreceptor，KRASandBRAFgenemutationsincolorectalcancerbyFQ．PCRcombinedwith~angersequencingCHENGPeng-~i，LINJia，TANGJing-fengWhanUniveFsityHospital，Whart430072，日beiProince，Gn口Correspondingauthor：TANGJing-fe

6、ng，E-mail：jin~Ceng@whu．edu．cn；jingleng9930@163．comAbstract：ObjectiveTodevelopareal—-timefluorescentquantitativePCR(FQ·-PCR)combinedwithSangersequencingmethodfordeterminationofepidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)，KRASandBRAFgenemutationsincolorectalcancer．MethodsPrimersandTaqMan

7、probesweredesignedbasedoncommonmutationsofEGFR。KRASandBRAFgeneincolorectalcancerforFQ—PCRamplificationusingthetumortissueDNAsof86patientswithcolorectalcancerastemplates．ThePCRproductsweredigestedwithSAPandEXOIandpurifiedbyethanol／sodiumacetatemethod．thensequenced．Thesequencing

8、resultwasanalyzedbyBioeditso'ware．ThemutationsofEGFR，KRASandB