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《丙型肝炎病毒核酸HCV-RNA扩增荧光定量检测标准操作sop.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、单位及实验室名称项目编号：日期：版本：丙型肝炎病毒核酸HCV-RNA扩增荧光定量检测标准操作程序1.目的：明确丙肝病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确进行丙肝病毒核酸定量的检测。2.适用范围：2.1适用于进行丙肝病毒核酸定量检测的检验人员。2.2适合仪器：LightCycler480型核酸扩增荧光检测仪2.3方法原理：采用PCR方法结合荧光探针的扩增技术2.4样品要求：血清3.职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。4.试剂来源：深圳凯杰公司HCVRNA荧光PCR检测试剂盒。5.质控物
2、：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒6.标准操作：6.1试剂准备（在试剂准备区操作）6.1.1将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻，完全融解后混匀。6.1.2根据当次实验标本量，取出相应试剂（1管=28ul反应液+2ulEnzymeMix）总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为n(n=标本数+1管阴性对照+1管阳性对照+1管临界阳性对照+4管阳性参控品)（定性检测无需做阳性参控品），取PCR反应管转移至样本制备区。6.2.实验前准备步骤：6.2.1所需试剂置室温平衡，
3、裂解液和洗液1如出絮状沉淀，37℃温浴至沉淀完全消失。6.2.2在洗液1中加入16ml无水乙醇，做好标记,室温保存,使用前摇匀。6.2.3在洗液2中加入23ml无水乙醇，做好标记,室温保存,使用前摇匀。6.2.4将310ul的洗脱液加入含有310ug的CarrierRNA中,充分混匀,分装,-20℃储存.不要反复冻融3次.6.2.5裂解液工作液的制备混合后2-8℃稳定保存48小时,裂解液工作液必须每次实验前新鲜配制ASJYK-LAB-C-P-46第2页，共4页裂解液工作液制备表人份数裂解液用量(m
4、l)CarrierRNA混合液用量(ul)HCV内对照用量(ul)人份数裂解液用量(ml)CarrierRNA混合液用量(ul)HCV内对照用量(ul)10.226.26.6132.8680.185.820.4412.313.2143.0886.392.430.6618.519.8153.3092.49940.8824.626.4163.5298.6105.651.1030.833173.74104.7112.261.3237.039.6183.96110.9118.871.5443.146.21
5、94.18117.0125.481.7649.352.8204.40123.213291.9855.459.4214.62129.4138.6102.2061.666224.84135.5145.2112.4267.872.6235.06141.7151.8122.6473.979.2245.28147.8158.46.2.6将1.4ml蛋白酶溶解液加入蛋白酶冻干粉试剂瓶中,混匀至完全溶解,避免有泡沫,2-8℃保存.6.3样本制备及加样（在标本制备区操作）6.2.1取n个1.5ml的灭菌离心管（n
6、=样本数＋1管阴性对照+1管强阳性对照＋1管临界阳性对照），做好标记。6.2.2分别加入25ul蛋白酶溶液.6.2.3分别加入待测样本,阴性对照,强阳性对照,临界阳性对照各200ul6.2.4加200ul新鲜配制的裂解液工作液盖上盖子,振荡15秒,混匀(不可把蛋白酶溶液加入到裂解液中).6.2.556℃温浴15min,瞬时离心,去除盖上液滴.6.2.6加入250ul无水乙醇,盖上盖子,振荡15s,室温静置5min.,瞬时离心,去除盖上液滴.(室温超过25℃,无水乙醇要预冷.)6.2.7将n个纯化柱
7、放入收集管中,将6.2.7的液体移入到纯化柱中,盖上盖子,6000g离心1min,倒掉废液.6.2.8打开纯化柱的盖子,加入500ul洗液1,6000g离心1min,倒掉废液.6.2.9打开纯化柱的盖子,加入500ul洗液2,6000g离心1min,倒掉废液.6.2.10打开纯化柱的盖子,加入500ul无水乙醇,6000g离心1min,倒掉废液.将纯化柱放入新的收集管中.6.2.1120000g高速离心3min,除去乙醇.ASJYK-LAB-C-P-46第3页，共4页6.2.12将纯化柱放入干净的
8、1.5ml离心管中,开盖,56℃温浴3min,以除去残留液体.6.2.13将纯化柱放入另一个干净1.5ml离心管中,加入60ul洗脱液(加到膜中央).盖上盖子,室温静置5min.20000g离心1min收集滤出液.4℃保存备用.应在2h内用于PCR扩增,或-70℃保存一个月6.2.14取20ul的6.2.13的RNA溶液及定量标准品,加入PCR反应管中.6.3PCR扩增（在扩增区操作）6.3.1打开稳压器电源，再打开计算机电源。6.3.2打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条
