利用家蚕杆状病毒表达系统表达葡萄白藜芦醇芪合酶基因.pdf

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1、药物生物技术PharmaceuticalBiotechnology2014，21(2)：107～110107利用家蚕杆状病毒表达系统表达葡萄白藜芦醇芪合酶基因潘晶晶，潘华晔，严珍珍，叶甫云，张耀洲，吕正兵(1．浙江理工大学生命科学学院，浙江杭州310018；2．浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室，浙江杭州310018；3．上海科爱生物技术有限公司，上海200233)摘要通过提取葡萄幼叶总RNA，用RT—PCR的方法获得白藜芦醇芪合酶基因，并将其成功克隆到pFast—BacHTA中，获得重组pFas

2、tBacHTA-STS载体，转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，筛选获得重组BacmidDNA后转染家蚕BmN细胞，进一步筛选获得重组杆状病毒，重组病毒接种家蚕蛹，工程蚕蛹匀浆后经初步纯化收获粗酶液，利用粗酶液对葡萄提取液进行转化，体外生物合成白藜芦醇，提取液中的白藜芦醇含量显示出明显的上升。该研究为体外生物合成白藜芦醇提供了新途径。关键词白藜芦醇；家蚕杆状病毒表达系统；体外生物合成中图分类号Q81文献标志码A文章编号lO05．8915(2014)02．0107．04白藜芦醇(Resveratrol，

3、简称RVS)是近年来植物中发现工大学生命科学学院生物化学研究所保存，RT·PCR试剂盒的一种植物多元酚物质，研究表明它是在植物受真菌感染购自Promega公司，pEASY-T1Simple购自公司北京全式金的时候自身产生的一种植物抗毒素⋯，具有抗癌引、抗氧生物技术有限公司。其它生化试剂购于上海生工，Super-化、抗凝血J、调节血脂、血管再生、影响寿命等多方面shift转染试剂购自Xtremegene9生物公司，无血清培养基有益于人类健康的重要功能。当前有学者在进行转基因技(CD．hybridoma)购

4、自Gbico，蛋白marker、核酸marker和限术合成白藜芦醇的相关实验j，该技术尚无法推广。从天制性内切酶购自Takara，引物由上海生工合成，家蚕五龄幼然植物中提取，虽然可以得到高活性的反式白藜芦醇，但是虫(品种为菁松×皓月)和家蚕蛹由浙江中奇生物药业股将会导致大量原材料的流失和环境问题，违背绿色科技的份有限公司提供。常规试剂配制如无特别说明，均参照《分理念；现有的化学合成方法，如Wittig法和Wittig．Homer子克隆实验指南》第三版。法、Perkin反应法、Heck反应法等都存在着产物

5、的顺反1．2方法异构选择性不高，收率低，生成的副产物难以除去，合成路1．2．1PCR引物设计根据NCBI报道的中国野生葡萄白线步骤繁多，价格昂贵等缺点；利用生物技术解决上述问藜芦醇芪合酶基因序列设计特异性引物，序列如下：P1题成为当前研究的关键。而目前，原核表达载体产生的5'-CGATGGcTrCAG1-IIGAGG一3；P25'-CCG：复杂的真核来源的蛋白生物活性较低或无活性，植物表TI'AATITGTAACCATAGG-3；P1、P2为葡萄白藜芦醇基因达系统一般产量低，周期长，难以大规模投入生产，

6、更难以满STScDNA的引物，Pl含有BamHI酶切位点，P2含有XhoI足市场需要；而酵母和动物表达系统生产药物成本高，产量酶切位点。低，这些问题都较难解决。综上，开发一条新型生物制药途1．2．2逆转录制备葡萄幼叶cDNA提取葡萄幼叶总径是解决上述问题的关键。本研究是一种利用Bac—to．BacRNA，按Promega公司ReverseTranscriptionSystem操作说系统”获得携带葡萄白藜芦醇芪合酶基因的家蚕重组杆明，进行逆转录，反应条件为42℃，l5—60min，95oC，加热状病毒，再

7、利用重组病毒生产白藜芦醇合成的关键酶(芪合5min，4℃孵育5min。酶)，初步纯化该工程酶，为将来能够以西瓜、葡萄等植物果1．2．3STS基因的扩增及pEASY—STS栽体构建和鉴定皮提取液为底物在体外生物合成白藜芦醇提供新途径。以葡萄幼叶cDNA为模板，P1、P2为引物PCR扩增STS基因，反应条件为94℃预变性5min；94oC变性30S，60．1℃1材料与方法退火30S，72℃延伸90S，共3O个循环；72oC延伸10min；1．1材料最后4oC保存备用。用1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物葡萄叶

8、片样品来源于浙江理工大学生活区，EcoliTG1后，PCR产物与pEASY．T1Simple载体室温连接30min，转菌种、载体大肠杆菌DH10Bac和pFastBacHTA均由浙江理化TG感受态细胞，用含Amp、IPTG和X—gal的平板进行蓝收稿日期：2013—07-07修回日期：2013—10—19作者简介：潘晶晶(1990-)，男，浙江绍兴人，主要研究方向：海洋药物，E—mail：243797614@qq．com。+通讯作者：吕正兵