hbv-dna_pcr检测规程

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1、HBV-DNAPCR检测规程1　目的规范LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）的检验工作，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测，保证检验结果的质量。2　范围本规程适用于LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）3　试剂中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸扩增荧光检测试剂盒4　仪器RocheLightCycler荧光PCR检测仪高速台式冷冻离心机微量加样器（覆盖1-1000μl）5　样品处理样品处理按《PCR实验室标本处理规程》进行收集和处理，具体操作见本规程附录1和附录2。6　测定6.1PCR扩增6.1.

2、1打开稳压器电源，再打开计算机电源。6.1.2打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。6.1.3将循环条件设定为：第5页共4页HBV-DNAPCR检测规程程序循环温度保持时间11次93℃2分钟240次93℃5秒57℃45秒31次40℃0秒6.1.4检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。6.1.5将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。6.1.6关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。6.1.7扩增结束后关闭扩增仪电源，取出PCR反应管，密封放入垃圾桶。6.2产物分析6.2.1条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件

3、，调整荧光数值为F1/F2。点击Quantification读取结果。6.2.2基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。6.2.3噪声容限（阈值）：调节在阴性质控品以上，要求在Step3：Analysis下相关性r值＜-0.97，接近-1.0。6.2.4对照标准：保证阴性质控品的Ct值不出现任何数值（默认为40）。6.2.5第5页共4页HBV-DNAPCR检测规程最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（M），关闭计算机。7结果判断7.1如果Ct值＝40，则实验样品的UUDNA含量（基因拷贝数/ml）＜1×103。7.2如果Ct值＜40，则实验样品的UUDNA含量（基因拷贝数/ml

4、）＝M7.3检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。8　注意事项8.1各标本沸水浴时间误差不超过1分钟。8.2加样时每加完一个要立即盖上封闭好离心管。9　支持性文件9.1《乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒操作说明书》8.2《临床基因扩增检验实验室工作规范》10　质量记录第5页共4页HBV-DNAPCR检测规程附录1：HBV项目标本采集、运送流程图医生填好申请单护士抽取清晨空腹静脉血2-3ml放至无菌的一次性无抗凝剂试管中，整个过程须注意勿溶血，管和验单均写上患者名字、盖好管盖。立即送检如延误，存放于-20℃冰箱保存，保存期为6个月实验室接收

5、标本合格标本有疑问标本不合格咨询临床通知临床重采样，并登记标本合格标本不合格登记、接收注意手及其它外物勿接触到血或管、盖内壁标本运送用0℃冰壶第5页共4页HBV-DNAPCR检测规程附录2：HBV样本处理流程图将血清标本6,000rpm.离心20s吸取上层血清40ul加入40ulDNA提取液上机扩增充分振荡充分混匀插入圆形卡盘倒置10秒100℃沸水浴10min10,000rpm离心5min4℃充分裂解6-8小时转置反应管6,000rpm离心20秒取上清2ul点样阳性标准品(1×108基因拷贝/ml)6,000rmp离心数秒阳性标准品的稀释及处理：以下步骤同标本处理加40ul40u

6、lDNA提取液分别吸取阳性标准梯度和阴性质控管各40ul以阴性质控品为稀释液将阳性标准品作107～104的倍比稀释充分混匀第5页共4页