mTOR信号通路在iPS定向分化RPE细胞中的调控机制研究-论文.pdf

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1、中华细胞与干细胞杂志(电子版)2014~f~2E第4卷第1期ChinJCellStemCell(ElectronicEdition)，Feb2014，v01．4，No．1·29·论著·mTOR信号通路在iPS定向分化RPE细胞中的调控机制研究蒋超石厚霞丁思加赵晨【摘要】目的探讨mTOR信号通路在iPS定向分化RPE细胞中的调控机制。方法培养iPS细胞，悬浮培养后形成拟胚体EB，诱导分化为RPE细胞。通过免疫细胞化学的方法，观察iPS．RPE细胞分化一个月后特异性蛋白(RPE65、LRAT、ZO．1)的表达。同时通过Q—PCR，WesternB

2、lotting的方法检测iPS．RPE在不同分化时问点(分化1个月、2个月、3个月)上，iPS．RPE细胞中特异性基因、蛋白的表达变化以及mTOR信号通路的活性。最后应用雷帕霉素抑制iPS—RPE细胞中mTOR的通路，进一步观察iPS—RPE细胞中的蛋白表达变化。Q．PCR采用单因素方差分析(One—WayANOVA)进行组间比较。结果荧光显微镜观察到iPS—RPE细胞在分化1个月时，表达RPE65、LRAT、ZO．1蛋白。与对照组iPS比较，Q．PCR结果显示，实验组RPE65在分化1个月，2个月，3个月时的表达量分别为0．84士0．13，

3、4．84-1．1，20．34-4．9(P=0．ooo)；Best1分化1个月，2个月，3个月时的表达量分别为1．54-0．16，2．34-0．68，l1．784-1．57=0．o00)；MerTK在分化1个月，2个月，3个月时的表达量分别为4．124-1．94，1．874-0．76，15．534-1．33(尸=0．oo0)，CK18分化1个月，2个月，3个月时的表达量分别为2．44-0．63，2．34-0．37，9．674-1．44(P=0．000)，WesternBlotting结果也表明，随着分化时间延长，iPS—RPE细胞中特异性蛋白(

4、BEST1、catenin、MerTK)表达量有显著提高，而mTOR信号通路的活性受到抑制。与对照组(加DMSO)比较，雷帕霉素处理获得的iPS-RPE细胞中BEST1、MerTK、ckl8蛋白表达量上升不是很明显，catenin蛋白显著提高。结论建立了体外高等分化、功能高效的iPS．RPE细胞，随iPS—RPE细胞分化时间延长，mTOR信号通路的活性是逐步抑制的。【关键词】潜能干细胞：视网膜；上皮细胞；细胞分化；信号通路ThemechanismofmTORsignalingpathwayintheregulationofdiferentia

5、tionofiPSintoretinalpigmentepithelialceHsJiangChao，ShiHouxia,DingSijia,ZhaoChen．DepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing21002~ChinaCorrespondingauthor．"ZhaoChen，Emaihdr．zhaochen@gmail．com【Abstract】ObjectiveToexploretheroleofmTOR

6、signalingpathwayintheregulationofdiferentiationofiPSintoretinalpigmentepithelial(RPE)cells．MethodsAfterembryoidbodieswereformedbyculturediPSinsuspensioncondition，theywereinducedtodiferentiateintoRPEcells．TheexpressionsofRPEspecificproteins(RPE65，LRAT，ZO一1)iniPS—RPEcellsduri

7、ngdifferentiationweredetectedbyimmunocytochemistry。O．PCRandWesternBlottingwerecarriedouttoanalyzeRPEspecificgenes，proteinsandmTORactivityiniPS—RPEatdiferenttimepointsofdiferentiation(afteronemonth，twomonths，threemonths)．Finally,iPS-RPEweretreatedwithmTORinhibitorrapamycinan

8、dRPEspecificproteinexpressionwasevaluated．ResultsTheRPEspecificproteins(RPE65，LRAT