慢性乙型肝炎证候差异基因表达谱分析-论文.pdf

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1、新中医2014年9月第46卷第9期·58·JOURNALOFNEWCHINESEMEDICINESeptember2014Vo1．46No．9慢性乙型肝炎证候差异基因表达谱分析管艳，苏式兵21．广州中医药大学2012级博士研究生，广东广州5104052．上海中医药大学中医复杂系统研究中心，上海201203[摘要]目的：通过检测分析慢性乙型肝炎(乙肝)肝肾阴虚证和肝郁脾虚证患者的差异基因表达谱，探讨乙肝中医证候分型与基因表达之间的关联。方法：采集乙肝患者和健康者的外周血样本，提取白细胞中的总RNA；运用基因芯片技术检测基因表达，并对其表达谱进行比较分析；使

2、用实时定量RT—PCR验证部分基因表达。结果：在乙肝肝肾阴虚证和肝郁脾虚证者之间、乙肝患者与健康者之间，基因表达谱都存在明显的差异表达。肝肾阴虚证单独调变的基因主要与氮氧化合物合成酶调节物活性、RNA多聚酶III转录因子活性和神经递质转运体活性等相关；肝郁脾虚证单独调变的基因主要与细胞动力学过程、多器官过程的调节和cAMP依赖性蛋白激酶PKA的活化等相关。实时定量RT—PCR的结果与基因芯片检测结果趋势一致。结论：乙肝肝肾阴虚证和肝郁脾虚证患者白细胞中基因表达存在差异，提示乙肝中医临床辨证分型具有分子生物学基础，与基因差异表达密切相关。[关键词]慢性乙型

3、肝炎；肝肾阴虚；肝郁脾虚；基因芯片技术；差异基因表达谱[中图分类号]R575．1[文献标识码]A[文章编号]0256—7415(2014)09—0058—03DOl：1O．13457／j．cnki．jncm．2014．09．028慢性乙型肝炎(乙肝)是由乙肝病毒(HBV)引起的一种世界1O例健康者。乙肝患者均来自上海中医药大学附属龙华医院性疾病。中国属HBV感染的高发区，一般人群的HBsAg阳肝病科，健康者来自经体检证明健康的志愿者，并签署知情同性率为9．O9％，乙肝患者约有3000万，已经成为严重的临意书。乙肝患者年龄3O～5O岁，平均474岁，未经过

4、治疗，床和公共卫生问题】。中医辨证治疗乙肝有着独特的作用，而由上海龙华医院肝病科具有正高级职称的医师辨证，均未合并确定中医证型是中医辨证施治的前提。因此，对乙肝进行中医它证。采集患者及健康者晨起空腹静脉血3mL，保存于含有辨证客观化、规范化的研究具有重要意义。随着系统生物学研15OLEDTA的2mL冻存管内，一2O℃保存。究和组学检测技术的发展，运用大规模、高通量的基因芯片检2研究方法测技术，对乙肝证候的基因表达谱进行定量分析，阐明证候分2．1RNA抽提和质量检测采用TRIzol~Reagent(Invitrogen型的分子生物学基础，已成为可能，是研究

5、证候客观化的基础lifetechnologies公司)对每例样本分别进行全血自细胞RNA工作之一。因此，笔者采集乙肝肝’肾阴虚证和肝郁脾虚证两种提取和纯化，操作流程严格按照该试剂盒提供的说明书进行。常见证候的临床信息和血液样本，采用基因芯片技术，检测并使用NanoDrepND一1000(ThermoFisher科技公司)进行质量分析乙肝肝肾阴虚证和肝郁脾虚证的差异基因及其表达谱，探检测，A260／A280在1．8～2．1之间为合格。讨乙肝中医证候分型与患者白细胞中基因表达之间的关联。2．2cDNA合成使用First—StrandcDNASynthesis

6、Using1临床资料M—MLVRT试剂盒(Invitrogenlifetechnologies公司)，取11．1诊断标准慢性乙型肝炎诊断和分期标准参照中华医学PgRNA在2OuL反转录体系中合成cDNA，并加入RnaseA会肝病学分会、感染病学分会制订的生乙型肝炎防治指南去除其中的RNA。(2010年版)》I2]。证候诊断标准参照中华中医药学会内科肝病2．3芯片杂交及检测芯片杂交由上海康成生物工程有限公委员会提出的龟寓毒性肝炎中医辨证标准(试行黟。司完成。所用的NimbleGenHomosapiens12xl35KArray表1-2一般资料用于芯片检测的

7、为6例乙肝患者(aT肾阴虚证达谱芯片(Roche，CATNo．A6484—00—01)共有135000个探者3例、肝郁脾虚证3例)和3例健康者：用于验证芯片结果针，可检测44049个基因。使用GenePix4000B芯片扫描仪的为2O例乙肝患者(肝肾阴虚证1O例、肝郁脾虚证1O例)和(Axon公司)扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字[收稿日期]2014—04—03[基金项目]国家科技重大专项课题(编号：2009ZX10004—601)[作者简介]管艳(1985一)，女，博士研究生，研究方向：肿瘤的基础及临床研究。新中医2014年9月第46卷第9期

8、JOURNALOFNEWCHINESEMEDICINESeptember2014