生化实验报告-离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶.doc

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1、实验报告一、实验目的和要求三、实验材料和主要仪器五、实验数据记录和处理七、实验讨论和心得二、实验内容和原理四、实验方法和步骤六、实验结果和分析一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法二、实验内容和原理1、离子交换层析由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂

2、的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。2、酶活力检测蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。（50℃水解）3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。（100℃显色）三、实验材料和主要仪器1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ）2、实验试剂⑴DEAE-SepharoseFastFlow⑵20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液⑶20mmol/LTris-HCl（1mol/LNaCl

3、）pH7.3缓冲液⑷0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5⑸5%蔗糖溶液⑹3，5-二硝基水杨酸试剂3、实验仪器（1）高速冷冻离心机（2）层析柱（φ1.0×20㎝）(1支/组）（3）ÄKTATMstart（1套/组）（4）部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组）（5）－20℃冰箱（保存样品用）（6）微量移液枪200ul、1000ul（7）1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）（8）7ml离心管（留样品Ⅳ用）（9）恒温水浴（50℃、100℃）（10）试管、移液管、试管架等四、实验方法和步骤1、仪器连接（1）接通各仪器电源，将A

4、,B泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。注意B为含NaCl溶液。（2）点击电脑桌面上Unicorn软件图标，打开软件。选择SystemControl，点击OK，进入操作界面。点击Connect（3）在操作界面的工具栏，点击MannualRun。出现FlowRate窗口，调节flowrate为1ml/min，确定。2、装柱与平衡（1）检查层析柱的两端接头，底端有膜的置于下方。（2）程序暂停。将层析柱放入卡槽，上端接头与混合器（Mixer)相连，下端接头与样品阀（Samplevalve)相连。（3）BufferA平衡一个柱体积（约20m

5、l=20min）3、加样停止加入20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时，程序暂停pause。旋开柱上方接头，用胶头滴管缓慢将5ml蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。程序继续continue，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，程序暂停pause，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加缓冲液至一定高度。4、洗脱（梯度洗脱法）（1）加样后，先用BufferA进行洗脱，洗去未被凝胶吸附的杂蛋白（20min左右

6、）；（2）待层析柱流出液在仪器上绘出的基线稳定，在程序主界面的工具栏Manual→Executemanualinstruction→pumps→Gradient，在两个框内均填入100，点击insert，最后点击一次execute，开始梯度洗脱。每2min接一管，当Conductivity上升至8mS/cm时，开始测定各管的蔗糖酶活力；（3）将蔗糖酶活力高的若干管酶液（2-3管）合并，测量总体积V4（样品Ⅳ），样品用7ml离心管－20℃保存。5、蔗糖酶活力检测空白对照（1）样品管（n）0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.50.5

7、ml0.5ml5%蔗糖溶液0.5ml0.5ml蒸馏水1.0ml0.95ml部分收集的酶液/0.05ml50℃水浴5min3.5－二硝基水杨酸试剂(DNS)0.5ml0.5ml100℃水浴2min蒸馏水3.0ml3.0ml观察颜色五、实验数据记录和处理上次实验粗提取的蔗糖酶蛋白溶液V3=12.3ml本次实验加样的蔗糖酶蛋白溶液V3’=5.0ml蔗糖酶活力高的两管酶液合并后V4=4.0ml六、实验结果和分析1、洗脱曲线（1）UV曲线①在55-70min时，UV曲线有两个峰值，这是未被凝胶吸附的杂蛋白的体现。②85-95min的峰值性

8、状较为“规准”，但经过活性检测发现为杂蛋白。③105-120min有一个峰值较小的峰，经过活性检测其中含有活性较高的蔗糖酶。实验名称：__离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶____姓名：吴逸璇学号：（2）在73min左右，BufferValveB的值瞬间上升，这是由于