线粒体膜分离--线粒体外膜-内膜的分离.doc

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1、线粒体膜分离线粒体膜分离方法主要是密度梯度离心１.配液：(1)10mmol/LPBSpH7.4。(2)0.25mol/L蔗糖-10mmol/LTris-HCLpH7.4。(3)用10mmol/LTris-HCLpH7.4配制25.2%、37.7%、51.7%、61.5%(w/v)的蔗糖液。２.操作步骤全部操作在冰浴中进行，溶液须预冷。(1)纯化的线粒体悬浮在10mmol/LPBS、pH7.4中膨胀20分钟，再以g离心60分钟，弃上清液，沉淀含内外膜。沉淀重悬浮于0.25mol/L蔗糖-10mmol/LTris-HCLpH7.4中以

2、11500g离心15分钟，上清液用于分离线粒体外膜，沉淀用于分离线粒体内膜。(2)线粒体外膜的分离:①吸取上述上清液，以g离心60分钟，弃上清沉淀重悬于适量的0.25mol/L蔗糖-10mmol/LTris-HCL溶液中。②用带长针头的注射器分别吸取3mL的25.2%、37.7%、51.7%蔗糖溶液，并以叠层铺在超速离心管中，制备不连续的密度梯度。③吸取2mL样品液小心加在25.2%蔗糖溶液的界面上。④以g离心45分钟，线粒体外膜处在样品液与25.2%蔗糖溶液的交界面上，用注射器收集线粒体外膜。(3)线粒体内膜分离：①把11500

3、g离心15分钟后的沉淀物重新置于适量的25.2%蔗糖溶液中。②用注射器吸取2ml的25.2%蔗糖溶液，另外分别吸取2.5mＬ的37.7%、51.7%、61.5%的蔗糖溶液，然后依次叠加超速离心管中，制成不连续的密度梯度。③吸取1.9mL样品液，加在25.2%蔗糖溶液界面上，以77000g离心90分钟，作第一次分离，在37.7%与51.7%蔗糖溶液界面下为内膜区带。④吸出内膜区带，加8倍体积蒸馏水并再次匀浆，然后以85000g离心30分钟，弃上清液，沉淀悬浮在0.25mol/L蔗糖溶液中。⑤分别取7.5mL的37.7%、51.7%、

4、61.5%的蔗糖溶液，在离心管中制成不连续的密度梯度。⑥吸取初步分离的内膜样品液7.5ml加在37.7%蔗糖溶液的界面上。⑦以77000g离心90分钟，作第二次分离，在51.7%蔗糖层中的上面区带为线粒体内膜，用注射器收集线粒体内膜